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实验介绍
taqman探针法：针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。
图：某基因的SNP（G>A）进行HRM分析的结果。左图为熔解曲线，右图为差异图
SNaPshot法：是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析（见下图）。
直接测序法：在所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP分析的金标准。纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。该技术主要通过直接测序的方法来确定位点的基因型，这种分型方法准确性最高，但费用大。如果需要检测的几个SNP位点正好位于一个测序单元内(长度小于700bp)，则单个位点的分型费用可显著降低，这种分型技术不失为一种良好选择。对于准确性要求特别高或样本量特别小(几个或几十个)的项目，这种分型技术很适合。
【实验流程】
探针匹配：可以收集荧光；
探针不匹配：不能收集荧光。
案例展示
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 动物组织 | 单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 种子样本 | 去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 贴壁/悬浮细胞 | 1. 总RNA或蛋白：106cell/指标、浆/核RNA或蛋白：107cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*107 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清样品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蜡包埋样品 | 由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm； 新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗体 | 1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物， 附带公司引物合成单。 | -20℃ | 冰袋或常温 |
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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