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WB实验技术介绍【新手入门】

2020-12-11 14:59:38

来源/作者:普拉特泽生物-医学整体课题外包

到九月了哦~娇小可爱的萌新师妹来了哦,有木有很开心呀!!

那么问题就来了:论如何在师妹面前装一手好Bility呢?不想装Bility的科研狗可不是正经科研狗,装不了Bility的科研狗更是没能力的科研狗!

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正所谓:爱也WB(顺利一跑就跑出来了),恨也WB(不顺利作死的也跑不出)。作为科研工作的基础实验技术,晓其原理、知其操作、懂其分析,并能做出一块“内参条带均匀平整,目的条带错落有序”的好膜,必将助你在装Bility路上独领风骚!


下面就简单介绍下WB实验技术:


1. Western blot是干啥的。简单来说就是①检测蛋白质混合溶液中某种特定蛋白质的存在与否(定性);②确定同一蛋白质在不同样本中的多与少(半定量)


2. 内参蛋白是啥玩意。内参就是内部参照,对于哺乳动物来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定。比如常用的内参β-actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。依据不同的目的蛋白选择合适的内参。


3. BCA法是个啥。碱性环境下蛋白质将二价铜离子还原成一价铜离子,BCA与一价铜离子结合形成紫蓝色络合物,在562nm处有最大吸光值且与蛋白浓度成正比。(个人觉得可以顺带给师妹讲一下ELISA酶联免疫吸附反应)


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4. 电泳之PAGE的浓缩效应与分子筛作用。①电泳开始阶段,由于不连续pH梯度而将样品压缩成一条狭窄区带,提高分离效果;②PAGE具有三维网状结构,能起分子筛作用。


5. 蛋白变性之SDS。影响电泳的3因素:蛋白质的大小、形状及所带电荷。①SDS结合蛋白质后再加热,能把折叠的蛋白质打开,排除形状的影响;②SDS带强负电荷,结合蛋白质后使其原有电荷微不足道,排除所带电荷的影响。SO,电泳结果只跟蛋白质分子量有关


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6. 十万个为什么之封水。封水目的是是分离胶表面平直并排除气泡,so,均匀且匀速,可以轻微晃荡(轻微啊!晃不好别怪我!)。胶水之间形成清晰界面是凝胶聚好的标志。


7. 十万个为什么之上样量一致。这个就不用多讲了吧。上样量不一致蛋白质含量不一致,最后的条带结果有什么意义呢?


8. 转膜的故事。这个也比较简单,手轻点不要弄破了、不要有气泡、膜的大小适合(PVDF膜还是有点小贵的,年轻人不要浪费!)。最好做个标记(我会在一个角剪一丢丢),标记正反面哦!


9. 封闭与抗体孵育的故事。一抗特异性结合蛋白质,标记有HRP(跟显色底物反应)的二抗特异性的结合一抗,易于检测。封闭就是为了防止抗体与膜的非特异性结合产生高背景。我一般一抗用一次,二抗回收(最多用三次)。脱脂牛奶容易发臭的!用不完及时丢!

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一点小建议

①请做一块好胶!胶的影响挺大的。玻璃板洗干净一点!

②预实验一定要做!怎么也得有三个抗体梯度吧。不然一顿操作猛如虎,条带结果一团糊。

③请做好个人防护,制胶材料有很多神经毒素的!