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实验介绍
【应用简介】
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR检测常用的两种方法：染料法和TaqMan探针法。
【技术原理】
TaqMan探针法核心是探针分子，TaqMan探针是单链DNA，5’端偶联发光基团，3’端偶联淬灭基团，游离的完整探针是检测不到荧光信号的，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性，遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
TaqMan探针法的特异性除了由引物提供，更由探针分子保证，因其退火温度更高，所以TaqMan探针法特异性更好，在一个反应体系中加入多条探针，可以做多个基因同时检测。
【实验流程】
案例展示
结果分析：NTC组正常，表明QPCR实验结果可信，组间差异较小，操作合格。
常见问题
一、引物设计
1、序列选取应在基因的保守区段；
2、Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp；
3、避免引物自身形成环状发卡结构。避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
4、典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；
5、引物之间的Tm值相差避免超过2°C；
6、引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
7、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；
8、探针位置尽可能地靠近上游引物；
9、探针的5'端应避免使用碱基G，引物的3’端避免使用碱基A。探针长度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C ,通常比引物Tm高5 ~10°C，GC含量在40%~ 70%；
10、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量；
11、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在Blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
二、热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
三、镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如：对DNA聚合酶的活性的影响进而影响产量;对引物退火的影响，进而影响特异性。若dNTP和模板同镁离子结合，则降低了酶活性所需要的游离镇离子的量。
四、模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中可能有多种污染物会抑制PCR。
五、防止残余污染
1、PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其它样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源(非残余污染)。
2、可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成份，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 动物组织 | 单个样品>0.1g，2mlEP管或冻存管装，不要过量；样本应尽量新鲜，如不能立即提取蛋白或核酸，应液氮速冻后冻存于-80℃或更低，冻存样本避免反复冻融以致降解 | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 种子样本 | 去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本，单个样品>0.2g。 | -80℃ | 干冰 | |
| 贴壁/悬浮细胞 | 1. 总RNA或蛋白：106cell/指标、浆/核RNA或蛋白：107cell/指标、线粒体RNA或蛋白：2*107 cell/指标，样本尽量新鲜，细胞收取后直接加Trizol（QPCR检测）或直接冻存于-80℃ 2. 若细胞处理（加药、转染、感染）后状态差应酌情加大收样量 | -80℃ | 干冰 | |
| 全血/血清样品 | 用抗凝管保存的外周血 5~10ml，骨髓 1~3ml； -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl，每 400μl 加入 400μl Trizol。 | -80℃ | 干冰 | |
| 石蜡包埋样品 | 由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块，有效厚度大于 0.1cm； 新鲜的 FFPE 组织切片，每片厚度不超过 10μm，2~8 张，表面积不超过 250mm2。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 抗体 | 1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体； 2. 按抗体说明书要求寄送，尽量避免分装；如分装，确保量足够进行实验，并提供抗体说明书。 3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记，抗体的量应大于实验所需的量。 | -20℃ | 冰袋 | |
| 引物 | 干粉，≥1OD，如进行预实验，每个基因至少提供两对引物， 附带公司引物合成单。 | -20℃ | 冰袋或常温 |
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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