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实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR检测常用的两种方法:染料法和TaqMan探针法。

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实验介绍

【应用简介】

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR检测常用的两种方法:染料法和TaqMan探针法。


【技术原理】

TaqMan探针法核心是探针分子,TaqMan探针是单链DNA,5’端偶联发光基团,3’端偶联淬灭基团,游离的完整探针是检测不到荧光信号的,发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭,探针被水解,发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时,模板链经热变性解链形成单链,TaqMan探针优先跟模板链退火,引物随后退火到模板上,之后进行链的延伸,延伸过程中Taq酶发挥5’-3’外切酶活性,遇到探针会从5’端逐个碱基切除探针,发光基团会跟淬灭基团分开,因此荧光检测系统可以接收到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。

TaqMan探针法的特异性除了由引物提供,更由探针分子保证,因其退火温度更高,所以TaqMan探针法特异性更好,在一个反应体系中加入多条探针,可以做多个基因同时检测。


【实验流程】

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案例展示

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结果分析:NTC组正常,表明QPCR实验结果可信,组间差异较小,操作合格。

常见问题

一、引物设计

1、序列选取应在基因的保守区段;

2、Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp

3、避免引物自身形成环状发卡结构。避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对;

4、典型的引物1824个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性,较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。Tm值在55-65℃GC含量在40%-60%

5、引物之间的Tm值相差避免超过2°C

6、引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;

7、为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子;

8、探针位置尽可能地靠近上游引物;

9、探针的5'端应避免使用碱基G,引物的3’端避免使用碱基A。探针长度通常在25~35bpTm值在65~70°C ,通常比引物Tm5 ~10°CGC含量在40%~ 70%

10、整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量;

11、为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在Blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。


二、热启动

热启动PCR是除了好的引物设计之外,提高PCR特异性最重要的方法之一。


三、镁离子浓度

镁离子影响PCR的多个方面,如:对DNA聚合酶的活性的影响进而影响产量;对引物退火的影响,进而影响特异性。若dNTP和模板同镁离子结合,则降低了酶活性所需要的游离镇离子的量。


四、模板质量

模板的质量会影响产量。DNA样品中可能有多种污染物会抑制PCR


五、防止残余污染

1、PCR易受污染的影响,因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时,会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其它样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源(非残余污染)。

2、可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域,在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成份,而不是每个反应的每个试剂单独加入。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




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