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CHIP检测

核酸和蛋白质是组成生命的主要生物大分子,两者的相互作用是构成生命活动的生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动的基础。研究蛋白质和核酸间的相互作用是人们探索生命现象奥秘的关键,CHIP检测实验是应用于蛋白与核酸互作关系的重要参考。

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实验介绍

【应用简介】

核酸和蛋白质是组成生命的主要生物大分子,两者的相互作用是构成生命活动的生长、繁殖、运动、遗传和代谢等生命活动的基础。研究蛋白质和核酸间的相互作用是人们探索生命现象奥秘的关键,ChIP检测实验是应用于蛋白与核酸互作关系的重要参考。


【实验原理】

CHIP实验在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。


【实验方法】

Step1:细胞培养物交联和样品制备

Step2: 胞核制备和染色质消化

Step3:染色质消化和浓度分析

Step4:染色质免疫沉淀法

Step5:将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads上洗脱下来并解交联

Step6:使用离心柱纯化 DNA

Step7:用 PCR定量 DNA



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案例展示

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【结果分析】

1、阳性对照组条带清晰无杂带,阴性对照组正常,表明CHIP实验结果可信,操作合格;

2、Input组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用于该指标的检测

3、样本组1和样本组2中检测XX蛋白组均有条带,表明该研究的基因的启动子区和XX蛋白可发生结合


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【结果分析】

1、阳性对照组条带清晰无杂带,阴性对照组正常,表明CHIP实验结果可信,操作合格;

2、Input组条带清晰可见,表明PCR扩增引物可用于该指标的检测

3、样本组中检测XX蛋白组无条带,表明该研究的基因的启动子区不可以和XX蛋白发生结合

技术总结

【常见问题】

1、消化的染色质浓度过低。

2、染色质消化不足且片段过大(大于900 bp)。

3、样品输入对照组PCR反应中无产物或产物很少。

4、阳性对照组蛋白H3-IP RPL30 PCR反应中无产物。

5、阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

 

【注意事项】

1、ChIP实验要求必须是新鲜的组织或活细胞,一次实验需至少需要150 mg新鲜的组织或2x10⁷个细胞,如不能提供新鲜的组织或活细胞,请联系客服,获得预处理方法;

2、部分抗体级别可能达不到ChIP级别的要求,需要采购对应级别的抗体并通过阴阳性实验反馈结果可信性;

3、ChIP对照:现有阳性对照H3和阴性对照IgG;

4、采用CST品牌的SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads)试剂盒用于本实验。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




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