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实验介绍
【技术原理】
RNA-FISH原理:如果待检测的细胞或组织切片上的靶核酸与所用的核酸探针是同源互补的,二者经‘’变性-退火-复性‘’,即可形成靶核酸与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素或直接标记荧光素,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应或直接经荧光检测体系在镜下对待测核酸(mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA)进行定性、半定量或相对定位分析的一种实验方法。
【实验流程】
案例展示
细胞的circRNA荧光原位杂交
注意事项
1、烤好的组织切片需经过脱蜡处理,二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等,影响实验结果。可根据实际情况延长脱蜡时间。
2、酶消化注意事项:
①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高,会对细胞的结构有一定的破坏,细胞核消失或细胞核辨认不清,也会造成一定程度的组织脱片;
②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻,降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率;
③消化酶均为现用现配。
3、由于荧光原位杂交探针杂交的区段长,在组织或细胞块切片中,可能出现人为的信号异常,如缺失、分离等。
送检与交付标准
样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
---|---|---|---|---|
新鲜组织 | 新鲜取材组织,用 PBS 清洗干净血液等,立即-80℃保存 | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识 |
一般固定组织 | 一般组织体积不超过2cmX2cmX0.5cm,固定时尽量保持组织的原有形态并清理干净血液及多余部分,如肠道内容物;固定液体积为组织大小的10倍以上,容器足够容纳组织不使其挤压变形。标注好固定液类型和固定时长 | 常温 | 常温 | |
特殊固定组织 | 睾丸、眼球、脊髓、肌肉等组织:推荐使用对应的特殊固定液进行固定,以保证固定效果。如Bouin液,适用于睾丸组织、皮肤组织及眼球的固定 | |||
组织蜡块 | 组织由标准的石蜡包埋盒包埋(尺寸为30*24*7mm),石蜡与组织要均匀接合,不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定,有效厚度至少要超过 0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块,超过半年的蜡块抗原可能丢失,做免疫组化可能出现检测不到蛋白。 | 常温 | 常温 | |
组织切片 | 需用防脱载玻片进行捞片,并注明切片厚度、已烤片温度与时间,组织应在靠近切片下端 1/3 处。 | 4℃ | 冰袋 | |
细胞爬片 | 使用 12 孔板或 24 孔板专用细胞爬片,细胞爬片经固定后用 PBS 洗涤 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每个爬片在孔板盖上应有唯一的标记,并有电子版的分组信息,以防标记在运输途中模糊。 | 常温 | 常温 | |
植物样本 | 新鲜组织FAA固定,木质化程度不高;对于较薄的叶片,如果要求平行叶片切片,难以保证切完整;根茎要求直径>1mm | 常温 | 常温 | |
抗体 | 保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,并附带说明书,抗体的量应大于实验所需的量。组织切片、组织芯片按稀释后 100μl 一张切片计算抗体用量, 24 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 200μl 一张计算抗体用量,12 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 400μl 一张计算抗体用量。 | -20℃ | 冰袋或干冰 |