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实验介绍
【实验原理】
TTC(2,3,5—氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物,它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体,与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色,而缺血组织内脱氢酶活性下降,不能反应,故不会产生变化呈苍白。故可以用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。
【实验方法】
Step1:取脑:可麻醉后直接取脑或经生理盐水灌注后取脑。因为脑组织未用多聚甲醛固定,所以较软,取脑时更应仔细,保持大脑的完整性;
Step2:-20℃冰箱中速冻20分钟左右,便于切片;
Step3:切片:一般切成5-6片,每隔2mm切一片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处;第二刀在视交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。如果需计算面积的话,应切得均匀或用专门的脑槽;
Step4:将切片置于2%TTC中;
Step5:用锡箔纸盖住后,放入37℃温箱15~30min,不时翻动脑片,使均匀接触到染色液;
Step6:取出切片后摆放整齐拍照。
案例展示
技术总结
【常见问题】
1、染色过浅:染色时间不够,适当延长染色时间;
2、切片破碎:取材不当,取脑时更应仔细,保持大脑的完整性。或速冻时间不够,切片时组织过软,适当延长冷冻时间
【注意事项】
1、因为脑组织未用多聚甲醛固定,所以较软,取脑时更应仔细,保持大脑的完整性;
2、切片时第一刀在脑前极与视交叉连线中点处;第二刀在视交叉部位;第三刀在漏斗柄部位;第四刀在漏斗柄与后叶尾极之间。如果需计算面积的话,应切得均匀或用专门的脑槽。
送检与交付标准
样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
---|---|---|---|---|
新鲜组织 | 新鲜取材组织,用 PBS清洗干净血液等,立即-80℃保存; | -80℃ | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识。 |
一般固定组织 | 一般组织体积不超过2cmX2cmX0.5cm,固定时尽量保持组织的原有形态并清理干净血液及多余部分,如肠道内容物;固定液体积为组织大小的10倍以上,容器足够容纳组织不使其挤压变形。标注好固定液类型和固定时长; | 常温 | 常温 | |
特殊固定组织 | 睾丸、眼球、脊髓、肌肉等组织:推荐使用对应的特殊固定液进行固定,以保证固定效果。如Bouin液,适用于睾丸组织、皮肤组织及眼球的固定; | |||
组织蜡块 | 组织由标准的石蜡包埋盒包埋(尺寸为30*24*7mm),石蜡与组织要均匀接合,不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定,有效厚度至少要超过0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块,超过半年的蜡块抗原可能丢失,做免疫组化可能出现检测不到蛋白; | 常温 | 常温 | |
组织切片 | 需用防脱载玻片进行捞片,并注明切片厚度、已烤片温度与时间,组织应在靠近切片下端 1/3 处; | 4℃ | 冰袋 | |
细胞爬片 | 使用 12 孔板或 24孔板专用细胞爬片,细胞爬片经固定后用 PBS 洗涤 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每个爬片在孔板盖上应有唯一的标记,并有电子版的分组信息,以防标记在运输途中模糊; | 常温 | 常温 | |
植物样本 | 新鲜组织FAA固定,木质化程度不高;对于较薄的叶片,如果要求平行叶片切片,难以保证切完整;根茎要求直径>1mm; | 常温 | 常温 | |
抗体 | 保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,并附带说明书,抗体的量应大于实验所需的量。组织切片、组织芯片按稀释后 100μl 一张切片计算抗体用量, 24 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 200μl一张计算抗体用量,12 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 400μl 一张计算抗体用量。 | -20℃ | 冰袋或干冰 |