小编看本文的时候有点艰辛吃力，本着学习的态度，想深入了解作者前期研究。

真是不看不知道，一看吓一跳~~~

这这这这。 。 。 这算是这位大神的低分之作

我我我我，我竟然都有点耍不明白了！

咱也不BB了，一起来拜读一下大神的“低分”之作吧。

先看结论！ （如图）

★ERK 通路的激活使 METTL3 和 WTAP 磷酸化。

★METTL3 的磷酸化增加了与 USP5 的相互作用，减少了泛素化，因此稳定m[6]A甲基转移酶复合物促进m[6]A。

★ERK/METTL3/WTAP 信号轴的激活促进干细胞分化和肿瘤发生。

通俗演绎就是：

ERK活化后促进肿瘤发生！

问：为什么会这样呢？

答：因为多能转录本衰变！

问：为什么会衰变呢？

答：因为增加了m[6]A修饰！

问：为什么会增加m[6]A修饰呢？

答：因为甲基转移酶复合物形成了！

问：为什么会形成呢？

答：因为METTL3/WTAP磷酸化了！

问：问什么会磷酸化呢？

答：因为ERK激活了它们！

问：为什么ERK会激活它们呢？

...再问我打人了啊！

要理清楚本文的研究思路，就先要知道（去）磷酸化、（去）泛素化、 m[6]A 这几个关键词。

咱们生物狗子都知道，中心法则是一切基础研究的生命之源。

本文的涉及的：

◆ m[6]A 发生在mRNA转录后，决定mRNA的稳定、翻译或降解。

◆（去）磷酸化发生在蛋白翻译后，决定蛋白质的活化状态。

◆（去）泛素化发生在蛋白翻译后，决定蛋白质的降解或存留。

最终行驶生命活动的单位是蛋白质，但在蛋白质前还有基因组的转录（主要为表观调控）、转录后的修饰（m[6]A、m[5]C等）、可变剪切（外显子跳跃、5端或3端内含子保留等导致的各转录本的形成）、成熟加工（pri-pre-matur的过程调节）、再到RNA翻译为不同的蛋白形式。 但蛋白在不同修饰状态下还会有不同的生物学功能，如磷酸化、甲基化乙酰化、糖基化、泛素化、二聚化、多聚化...

等 ...

我们捋一下本文的Result

Fig1. ERK 激活促进 mRNA m[6]A 甲基化

先看个背景知识补充， 方便理解Fig1

2015年有文献报道含有IRES的circRNAs能够在真核细胞内编码蛋白，接着又发现了不含IRES的阴性对照组circRNAs也能在人类细胞中翻译！此类不含IRES能够翻译的circRNAs有共同的GGACU的序列特征，推断甲基化驱动翻译。

☆1A： 为了鉴定m[6]A RNA甲基化的调节因子，在 HeLa 细胞中使用了包含共有 GGACU 基序 的环状RNA GFP报告基因。 GFP 前体 mRNA转录物通过反向剪接组装以生成连接 GFP 的两个外显子片段的环状 RNA，如图 1A 所示。 m[6] 环状 RNA 上 GGACU 基序的甲基化可以驱动 GFP 转录物的翻译起始，产生 GFP 荧光信号。 因此，来自该环状 RNA 报告基因的GFP信号可用作 m[6]A 甲基化的读数。

☆1B: 针对19,050 个基因和1,864 个 microRNA (miRNA) 进行了基于 CRISPR 敲除的基因组筛选。 将 CRISPR 敲除文库与 circRNA m[6]A-GFP 报告基因相结合，可以筛选 m[6]A 甲基化的可能调节因子。 敲除促进或抑制 m[6]A 甲基化的基因将分别减少或增加 GFP 转录本的翻译。 作者收集了具有 GFP 表达的最多和最低 5% 的细胞，然后进行高通量测序以分别鉴定 m[6]A 甲基化的负调节因子和正调节因子。

☆ 1C: 正如预期的那样，METTL3 的敲除导致屏幕中的 GFP 信号较低。

☆ 1C-D: 低 GFP 表达细胞中 gRNA 的通路富集分析RAS 和 MAPK信号通路的基因 最多。

补充图中发现：m[6]A 甲基转移酶复合物 (METTL3-METTL14-WTAP) 的过表达降低了野生型 RRACT 但不降低突变型 RRTCT 报告基因的表达。为了确定 ERK 如何激活 m[6]A 甲基化，作者首先测试了 ERK 是否与 mRNA m[6]A 甲基转移酶复合物相互作用。免疫共沉淀表明，在 BRAF 转染后，METTL3 与 ERK1 和 ERK2 结合（图 S2A）。

Fig2. ERK 磷酸化 METTL3 和 WTAP

Trametinib ： MEK抑制剂，是一种高特异性的，有效的MEK1/2抑制剂，可激活自噬并诱导凋亡。

A375 细胞 ： 是一种由于 BRAF V600E 突变而具有组成型活性 ERK 的人类黑色素瘤细胞系。

☆ 2A ： 在 A375 细胞中观察到内源性 ERK2 与 METTL3 和 WTAP 的相互作用，A375 细胞是一种由于 BRAF V600E 突变而具有组成型活性 ERK 的人类黑色素瘤细胞系（图 2A）。

☆ 2B ： ERK 使用一个共同的 对接域 (CD)与 D 域结合（K/R0–2-X1–6-φ-X- φ) 或绑定到 F 域 (FX-F/YP)。 使用真核线性基序数据库 (http://elm.eu.org) 的分析显示 METTL3 中的残基 415-421 和 WTAP 中的残基 71-77 是潜在的保守 D 域。

☆ 2C: ERK2 的 CD 突变体（321N） 解除了 METTL3 和 WTAP 的相互作用，而 FRS 突变体（263A） 没有。 免疫共沉淀 (co -IP) 显示 ERK2 仅与 D 域所在的 myc 标记域结 合（图 S2D）。 这些结果支持 ERK 与 METTL3 和 WTAP 的交互。

☆ （图 S2F）进一步验证了 METTL3 是否是 ERK 的底物。 体外激酶测定表明 ERK 直接磷酸化 METTL3。

☆ 2D-F： 质谱分析表明 ERK 磷酸化METTL3 在三个高度保守的残基： S43、S50 和 S525。 突变分析进一步证实这三个位点是主要的 ERK 磷酸化位点（图 2F）。 【图中 3A 组： 指 METTL3所有三个磷酸化丝氨酸位点都被丙氨酸取代 】

☆ 2G-H ： 为了确定 WTAP 的磷酸化位点，检测了 S/TP 基序的突变是否影响 ERK 诱导的磷酸化。 在人类 WTAP 的三个 S/TP 基序中，我们发现 S306 和 S341 是人类 WTAP 的主要 ERK 磷酸化位点。

接下来作者探讨了 ERK 诱导的磷酸化如何增加 RNA m[6]A 甲基转移酶复合物的活性。

Fig3. ERK 介导的 METTL3 稳定需要 USP5

在分子生物学中放线菌酮可被用来确定蛋白质（酶）的半衰期。 使用放线菌酮处理细胞，然后使用western blot实验来显示要被研究的蛋白质随时间的数量变化。 由于放线菌酮阻碍蛋白质的合成，细胞内的蛋白质不断减少。

☆ 3A ： METTL3 在 mESC 和人 A375 细胞中WT组始终比 3A 组更高的表达水平， WTAP也是WT组比2A组始终表达高 。 这一观察结果提出了一个假设，其中 ERK 使 METTL3 磷酸化稳定了蛋白质，这可以解释更 好的ERK 激活观察到 METTL3 蛋白水平和 m[6]A 甲基化活性升高。

☆ 在补充图里研究了 ERK 激活是否会影响 METTL3 稳定性，用ERK抑制剂 PD0325901 处理8h，增加了蛋白的泛素化（图 S3A）。

☆ 3B ： 3A 组的 METTL3的 泛素化水平也高于 WT 组。

☆ 3C： 为了更直接地评估 ERK 对 METTL3 稳定性的影响，使用放线菌酮抑制蛋白质合成，并监测 METTL3 蛋白质降解情况。 如图 3C 所示， ERK 激活增加了 WT 的稳定性，但没有增加不可磷酸化的 3A METTL3 ； 与 WT METTL3 相比，磷酸化模拟物 3E METTL3 显示出稳定性的增加。

为了进一步了解 ERK 磷酸化如何降低 METTL3 泛素化，补充图中发现 USP5 和 USP1的敲低降低了 A375 细胞中的 METTL3（图 S4B）。市售的 USP1 抑制剂 SJB3-019A 和 USP5 抑制剂 EOAI3402143 (EOAI) 也降低了 METTL3（图 S4C）。考虑到 USP5 涉及广泛的病理过程，并且对 METTL3 的影响最显着，选择进一步研究它。

☆ 3D ： 随后研究了在活化的 BRAF 存在下 METTL3 的磷酸化是否会影响 METTL3-USP5 相互作用。 作者注意到 ERK 激活增加了 METTL3 和 USP5 之间的相互作用，这种相互作用随着磷酸缺陷突变体 S43A、S50A、S525A 变弱，并在所有三个位点都发生突变时完全减弱。 3E METTL3 与 USP5 的结合更强。 BRAF 表达也进一步促进了 3E METTL3-USP5 相互作用并增加了其表达。 这表明 BRAF 也可能影响 USP5 活性。

因为 USP5 是一种可以阻止蛋白质泛素化的酶，进一步验证了 USP5 是否通过去泛素化稳定 METTL3。

☆ 3E ： WT 组（过表达 USP5 ）比 C335A 组（过表达突变的 USP5 ）降低了泛素化并稳定了 METTL3。

☆ 3F： 找到 抑制 USP5 而诱导 METTL3 的降解的泛素连接酶， 作者搜索了共识基序和物理关联数据库以及基于 CRISPR 的基因组筛选。 METTL3 包含 SPOP 结合共识基序和 COP1 结合破坏基序 (http://elm.eu.org)。 它还与 TRIM28、HUWE1 和 UBR5 (https://thebiogrid.org) 相互作用，并且可能被 SMURF1 (
http://ubibrowser.ncpsb.org) 泛素化。从 CRISPR 筛选中鉴定出 FBXW8、FBXW12、SPOPL、TRIM2 和 ANAPC1 作为 m[6]A 甲基化的负调节因子。 为了找到参与 METTL3 降解的泛素连接酶，用靶向泛素连接酶的小干扰 RNA (siRNA) 进一步转染 USP5 敲低的 A375 细胞。 敲除 SPOP、TRIM28 或 ANAPC1 部分消除了 USP5 抑制介导的 METTL3 降解。

总之，这些结果表明 USP5 通过去泛素化稳定 METTL3

Fig4. ERK 对 METTL3/WTAP 的磷酸化促进 细胞分化

mESC： 小鼠胚胎干细胞

据报道，自分泌 FGF4 是 mESC 中 ERK 信号传导的主要刺激物。FGFR 或 ERK 活性的干扰阻碍了 mESCs 进行分化和保留多能性因子（包括 Nanog）表达的能力。

作者观察到 p-43 METTL3 磷酸化被 FGF4 增强并被 MEK 抑制剂 PD0325901 或 FGFR1 抑制剂 PD173074 降低（图 S5A）。 因为据报道， mESCs 在分化时退出多能状态需要 ERK 激活和 METTL3 表达， 因此作者进一步研究了 METTL3/WTAP 的磷酸化是否影响 mESC 命运 。

☆ 4A ： 将 TetOn-shWTAP 引入 METTL3 敲除 (KO) 的 mESC 以调整内源性 WTAP 表达。 然后用 WT 或磷酸失活突变体 CuO-METTL3-T2A-WTAP 转 染细胞。 通过液相色谱-串联质谱（ LC-MS/MS ） 对 m[6]A 的定量显示出 3A METTL3 和 2A WTAP 的协同减少。

☆ 4B ： R-3A2A mESCs 表现出更高的增殖增加和阶段特异性胚胎抗原 1 (SSEA-1) 表达（图 S5C）。 这些观察结果支持 METTL3 和 WTAP 磷酸化的丧失将 mESC 维持在多能状态的观点。

☆ 4C ： m[6]A 甲基化多能性因子转录本，包括 Nanog、Zfp42、Klf2、Sox2 和 Lefty1。 不含任何 m[6]A 修饰的 Pou5f1 也用作阴性对照。 m[6]A-RIP-qPCR 证实 m[6]A 减少，qRT-PCR 表明这些 m[6]A 标记的多能性转录本在 R-3A2A mESC 中上调（图 4D）。

☆ 4E ： R-3A2A mESCs 未能抑制多能基因，并充分上调发育标记 物的指标。

这些结果支持 METTL3 和 WTAP 的 ERK 依赖性磷酸化促进 mESC 分化的观点。

Fig5-6. 受 mESC 中甲基转移酶复合物磷酸化影响的转录本

为了进一步了解 m[6]A 甲基转移酶复合物的磷酸化如何影响 m[6]A 修饰的转录本，作者绘制了 mESC 中的 m[6]A 甲基化组。

☆5A ： R-WT 与 R-3A2A mESC 的比较揭示了甲基化位点的整体丢失。

☆ 5B-C： 使用作者内部 R 包“MeRIPtools”： 它使用基于二项分布的模型测试 m[6]A IP 富集； 发现 7,591 m[6]A 峰显示 R-3A2A 细胞显着减少与 R-WT 细胞相比，例如 Nanog、Lefty1 和 Zfp219 中的修饰位点（图 5C）。

☆ 5D-F： GO分析， m[6]A 甲基化降低（图 5D）和差异表达（图 5E）的转录本富集了与多能性和 mRNA 加工相关的基因。 重要的是，与 R-WT mESCs 相比， 许多参与多能性的基因在 R-3A2A 细胞中显示出降低的 m[6]A 甲基化 （图 5F）。

☆ 6A-B ： 正如预期的那样，m[6]A 甲基转移酶复合物在 R-3A2A A375 细胞中的稳定性降低，这导致 mRNA 的整体 m[6]A 水平较低（图6B）。

☆ 6C-D： 发现 MEK 抑制剂 PD0325901 和Trametinib 可减少蛋白质A375 黑色素瘤细胞中 m[6]A 甲基转移酶复合物的水平 （图 6C） 和整体 mRNA m[6]A 水平 （图 6D）。

☆ 6E ： 使用两种结构无关的 USP5 抑制剂 EOAI 和 vialinin 来评估 USP5 对黑色素瘤中 METTL3 水平的影响细胞。 发现这两种 USP5 抑制剂增加了 METTL3 的泛素化，导致 METTL3 蛋白水平降低 （图 6E、S7E 和 S7F）。

☆ 6F ： MEK 抑制 剂， R-3A2A 或 METTL3-WTAP 敲低可使黑色素瘤和结肠癌细胞对 USP5 抑制敏感（图 6F 和 S7G），支持 USP5 和 METTL3 之间的联系。

最后，考虑到 HER2 表达使 METTL3 和 WTAP 磷酸化（图 S1C 和 S7H），并且过表达 HER2 的 SKBR3 和 BT474 细胞中的 m[6]A 水平更高（图 S7I），研究了抑制 HER2 是否会影响 m[6] ]甲基化。

☆ 6G-H： 两种 HER2 抑制剂，tucatinib 和 lapatinib，可以降低 HER2 阳性乳腺癌中 METTL3 蛋白水平和 mRNA m[6]A 甲基化（图 6G 和 6H）。

总体而言，这些数据 支持 ERK 依赖性 METTL3 稳定性影响细胞 mRNA m[6]A 甲基化，这可能有助于肿瘤发生。

好了文章就到这里了，

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