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2024-04-24 15:21:06
实验介绍
【应用简介】
肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基底膜的层粘连蛋白、纤维连接蛋白和IV型胶原等相粘连，然后肿瘤细胞可释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原，使基质成分降解，最后肿瘤细胞运动而充填到被水解了的基质的空隙处，如此三个过程不断重复肿瘤细胞不断向深层侵袭。
【技术原理】
本实验采用的Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可穿过多孔滤膜，侵袭细胞经染色后，在显微镜下观察和计数。
【实验方法】
Step1：制备条件培养基
Step2：包被基底膜
Step3：水化基底膜
Step4：接种细胞
Step5：培养细胞
Step6：固定及染色
Step7：镜检
案例展示
技术总结
1、24孔板下室一般加入600ul的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡， 要将小空提起，去除气泡，再将小室放进培养板；
2、接种的细胞应选择处于对数生长期且状态良好，细胞计数需准确；
3、待细胞迁出，且形态展开后即可固定染色；
4、染色后，可用棉签轻轻擦掉上层未迁出细胞；
5、拍照时，同一视野不可重复拍照，膜上小孔清晰，细胞形态明显，所有照片的背景需统一。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 冻存细胞 | 1.取对数生长期的细胞，消化离心收集细胞，加入冻存液吹打混匀，装入冻存管，标明细胞名称/细胞代数，冻存细胞数量在1-5*106个/ml。 2.项目启动后细胞复苏，复苏后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 复苏后细胞 | 1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上，装满培养液，只留纽扣大小的气泡，瓶口用封口膜封好，标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型，瓶子固定运输。 2.收到细胞后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 常温 | 常温 | |
| 质粒 | 1.纯度高，无内毒素，无蛋白质，基因组DNA/RNA污染，质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间 2.浓度不低于0.5μg/μl，总量大于100μg，无内毒素处理 3. 载体详细信息，包括名称、大小、抗性、荧光标记 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类，最好需要提供病毒载体图谱； | -80℃ | 干冰 |
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