DNA染色法检测支原体步骤由普拉特泽生物为大家总结分享，DNA染色法是常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法。普拉特泽生物表达检测平台长期为基础科研人员提供支原体检测外包服务，保证结果真实。

  DNA染色法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域，由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%），所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。我们来一步步看：

  一、实验准备

        1、CO2 培养箱、无菌小爬片。无菌培养皿、不含抗生素的完全培养液

        2、二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml) 。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100 ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中，在室溫下用磁力搅拌30~40 min, 使完全溶解，-20℃ 避光保存。

        3、二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1 ml 上述浓缩液，加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中，终浓度为0.5μg/ml 。

        4、固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。

        5、封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml，0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH 至5.5 。

        6、不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的VERO 细胞。

        二、DNA染色法检测支原体操作步骤

        1. 无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。

        2. VERO 细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加VERO 细胞悬液(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml, 置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。

        3. 制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h 后( VERO 细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。

        4. 漂洗—将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS） 漂洗3次。

        5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3) 固定液固定 10 min 。

        6. 漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3 次。

        7. 染色—置于Hoechst 33258 工作液(0.5μg/ml) 中染色10 min 。

        8. 漂洗—去离子水中漂洗3 次，每次1 ~2 min 。

        9. 封片，紫外激发，观察。

        三、实验结果判断

        当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效。

        1. 阴性结果仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。

        2. 阳性结果荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

        四、DNA染色法检测支原体注意事项

        1. 严格配制工作液及封片液。

        2. 保证作为指示细胞的VERO 细胞没有被支原体污染。

        3. 必须同时设立阳性及阴性对照，注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。
  4. 应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。

        5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。

     好啦，介绍完啦，是不是很简单？如果您有其他的问题或有支原体检测外包的需求可以直接留言！普拉特泽生物技术会第一时间解答和回复的~