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支原体检测

支原体是细胞外生存的最小微生物,是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。通过对支原体特定的序列设计引物,当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增,会将目标DNA特异性地复制,然后通过琼脂糖电泳检测,会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时,由于没有模板,PCR无法扩增,则琼脂糖电泳跑不出条带,出现阴性结果。

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实验介绍

【实验原理】

原核生物的rRNA碱基序列非常保守,而rRNA操纵子上编码rRNA的DNA间隔区如16S和23S间隔区,各种生物种间的碱基序列差别很大。这个间隔区的 DNA序列及长度在 Mycoplasma 各个种间既有相对保守的部分,也有具有很大差异的部分。本制品是在编码 16S 和 23S rRNA 的 DNA 上设计一对 F1/R1 引物,扩增编码 16S 和 23S rRNA 的 DNA 间隔区。此反应体系只特异性扩增 Mycoplasma DNA,检出灵敏度与特异性都很高。

通过对支原体特定的序列设计引物,当存在支原体污染时通过PCR特异性扩增,会将目标DNA特异性地复制,然后通过琼脂糖电泳检测,会跑出条带出现阳性结果。反之当没有支原体污染时,由于没有模板,PCR无法扩增,则琼脂糖电泳跑不出条带,出现阴性结果。


【实验流程】

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案例展示


 支原体检测_副本.png

3个样本的支原体检测,分别设置阳性对照Pc: Positive  control,阴性对照Nc: Negative control,待测样本123

常见问题

1、取待检样本:

一般是接种后进行 3-6d细胞培养的培养上清液;

如果使用 Eagle 等常用的细胞培养基时,培养上清可直接加入到 PCR 反应液中;

如果使用细胞悬浊液作为样品,则需要提取 DNA,再进行 PCR 反应。    

2、一定要设置阳性对照(一般采用带有支原体特异片段的质粒)与阴性对照(H2O);

3、配制PCR反应体系时需在超净工作台里进行,避免污染。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




细胞交付标准.jpg