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2024-04-26 11:50:56
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2024-04-22 12:45:38
克隆形成
【应用简介】
克隆形成及细胞克隆接种存活率，通过观察单细胞集落形成情况，来计算克隆形成率，了解其增殖能力。
【技术原理】
单个细胞在体外持续增殖6代以上时细胞数量已达60个左右，此细胞群体成为克隆或集落，大小在1.0-2.0 mm之间。集落形成率表示细胞的独立生存能力，各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变，通过计数克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析，了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。软琼脂培养或平板克隆是最常用的方法。
【实验方法】
Step1：细胞培养，调整细胞状态
Step2：制备单细胞悬液
Step3：按不同的细胞浓度梯度把细胞均匀接种于培养平板
Step4：培养一段时间
Step5：观察克隆情况，固定染色后计算克隆形成率
案例展示
不同肿瘤细胞的平板克隆
技术总结
1、对数生长期，细胞状态良好的情况下，0.25%胰酶消化，离心后重悬时一定要吹打成单细胞悬液。可以选择6孔板作为克隆培养板，按密度梯度（如100、200、300）接种进孔板中。接种后切记晃动平板，使细胞分布均匀。
2、培养2周左右（出现肉眼可见细胞集落时），即可固定染色。加固定液和染色液时，覆盖住孔板底层即可。但如果长时间不处理，需增加液体量，防止液体干涸，影响拍照效果。
3、拍照时，务必使每个孔中无阴影，如无法达到，则逐个孔进行拍照。
送检与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 冻存细胞 | 1.取对数生长期的细胞，消化离心收集细胞，加入冻存液吹打混匀，装入冻存管，标明细胞名称/细胞代数，冻存细胞数量在1-5*106个/ml。 2.项目启动后细胞复苏，复苏后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 复苏后细胞 | 1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上，装满培养液，只留纽扣大小的气泡，瓶口用封口膜封好，标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型，瓶子固定运输。 2.收到细胞后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 常温 | 常温 | |
| 质粒 | 1.纯度高，无内毒素，无蛋白质，基因组DNA/RNA污染，质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间 2.浓度不低于0.5μg/μl，总量大于100μg，无内毒素处理 3. 载体详细信息，包括名称、大小、抗性、荧光标记 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类，最好需要提供病毒载体图谱； | -80℃ | 干冰 |
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