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核质分离检测不同组分的基因表达

考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对病理组织内的蛋白质进行染色。通过PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核质分离试剂盒将细胞的胞核与胞质分开,提取这两部分的RNA,进行QP检测。检测胞质与胞核中目的基因及内参基因的表达在细胞总表达的占比。

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实验介绍

实验原理

通过PARISTM Kit Protein and RNA Isolationg System 核质分离试剂盒将细胞的胞核与胞质分开,提取这两部分的RNA,进行QP检测。检测胞质与胞核中目的基因及内参基因的表达在细胞总表达的占比。

实验方法

Step1: 细胞收集之后,预冷的PBS清洗一遍,3000g离心5min后取上清,置于冰上。加入合适体积预冷的Cell Fractionation Bufeer 重悬细胞,轻轻打匀。冰上孵育10min

Step2: 孵育10分钟后,500g,4℃离心5min,分离胞浆和胞核。上清转移至新的无RNA酶的EP管中,置于冰上,此为胞浆。

Step3: 胞核沉淀加入预冷的Cell Fractionation Bufeer 重悬,吹打混匀后500g4℃离心1min,去上清。胞核沉淀中加入预冷的Cell Disruption Buffer ,冰上裂解至溶液均一。(裂解至溶液透明)

Step4: 胞浆和胞核中分别加入等体积的2X Lysis/Binding Solution,上下颠倒混匀,室温裂解。

Step5: 加入与裂解液相同体积的无水乙醇,混合均匀。

Step6: 将混合液分别置于滤柱中过滤,10000g,室温离心1min,丢EP管,转移滤柱至试剂盒提供的EP管中进行清洗。

Step7: 加入700ulWash SolutionⅠ10000g,室温离心1min。倒掉液体,滤柱中加入500ulWash Solution2/3,10000g,室温离心,10000g,室温离心1min

Step8:倒掉废液,空管离心一次,10000g,室温离心1min,更换EP管。

Step9:DEPC水加热到95-100℃加35ul至滤柱中央,10000g室温离心30s。丢弃滤柱,分别得到胞浆和胞核的RNA。


案例展示

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左:扩增曲线; 右:溶解曲线

通过监测不同循环阶段的荧光强度,直至曲线平滑达到细胞中该基因的表达高峰。Ct值越低,表达越高。


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 通过2-meanCt公式计算基因在胞核与胞质的表达大小,绘制柱状图,得到基因在胞核与胞质中的表达占比。

 


技术总结

注意事项:

1. 2X Lysis/Binding Solution可能在4°C下凝固。使用前,将溶液加热至37°C,偶尔搅拌5-10分钟,或直至完全溶解。

2. 洗脱水需要在95-100℃水浴锅中预热,更好的洗脱柱膜上的RNA,不过由于洗脱温度过高可能会导致RNA有些许降解。

 

交付标准

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还(超过周期,不予返还)