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ELISA酶联免疫吸附

酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等,具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

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实验介绍

【实验原理】

它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。

在这种测定方法中有3种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体(免疫吸附剂);②酶标记的抗原或抗体(标记物);③酶作用的底物(显色剂)。

测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后,再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单,方便迅速,特异性强。


【实验方法】


Step1: 加待测样,温育、洗涤

Step2: 加酶标抗体,温育、洗涤

Step3: 加底物,温育显色

Step4: 加终止液

Step5: 读数

案例展示


           ELISA_副本.jpg


ELISA检测2组样本中bFGF蛋白含量

技术总结

加样本和反应试剂时必须注意避免以下几点:

1、加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性。需匀速加样,吸样时,加样枪需按到第一档,加样时,加样枪需直接按到底;

2、加样应直接加入反应孔底部,加在反应孔壁上易溅出会对邻近孔产生污染。尽量避免出现气泡;

3、反应试剂的加入时先要注意试剂的有效期,再注意滴加的角度和滴加速度。滴加太快易出现重复滴加在两孔之间。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




细胞交付标准.jpg