首页 > 技术文章 > m6A甲基化研究思路设计方法

m6A甲基化研究思路设计方法

2021-10-26 15:44:54

来源/作者:普拉特泽生物-医学整体课题外包

今天,我们来着眼于国自然热点-表观遗传调控相关的文献,主题方向是RNA甲基化

那什么是RNA甲基化呢?

表观遗传RNA甲基化

RNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下,RNA的甲基腺嘌呤被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象,主要形式为m6A甲基化。m6A甲基化修饰是可逆化的,包括甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)等共同参与。与人类的发育,免疫,肿瘤生成和转移,干细胞更新,脂肪分化等过程息息相关,因此,RNA甲基化已成为科研中一个重要且热门的研究方向。

接着,我们来了解下RNA甲基化现在的究行情~~

先从pubmed分析一下RNA甲基化这一热点问题的研究情况吧!在pubmed数据库中输入“RNA Methylation”,文章数量为44095篇,并在近10年来研究势头居高不下。

表观遗传RNA甲基化

从国自然立项情况来看,近十年来,立项项目的数目也一直在稳步增长的状态。

表观遗传RNA甲基化

既然m6A甲基化热度不减。

那么,究竟如何检测m6A?

整体思路如何设计?

我们跟着今天介绍的这篇SCI一起来学习学习吧。

表观遗传RNA甲基化

文献题目是:Methyl CpG binding protein 2 promotes colorectal cancer metastasis by regulating N6-methyladenosine methylation through methyltransferase-like 14. 影响因子6.711分,刚刚热乎乎的发表在Cancer science杂志上。主要研究MeCP2与甲基转移酶14(METTL14)结合,通过改变m6A甲基化修饰来调节肿瘤抑制因KLF4的表达,进而影响结直肠癌的进展。

接下来我们跟着作者的思路一起来看看吧!

一、MeCP2基因在结直肠癌(CRC)临床样本中的研究。

作者首先用WBIHC方法发现了MeCP2蛋白在癌旁组织中的表达显著高于正常组织(Figure 1A - 1C),同时MeCP2 mRNA表达的升高与预后较差相关(Figure 1D)TCGA数据总生存率分析亦显示高MeCP2表达与预后较差呈正相关(Figure 1E)。以上结果说明:CRC肿瘤样本中MeCP2表达增加,与预后差相关,MeCP2可能是CRC的致癌基因。

表观遗传RNA甲基化


二、MeCP2促进CRC的转移、减弱CRC细胞的m6A水平

为了进一步确定MeCP2CRC中的生物学作用,作者在HT29、HCT8SW620细胞中敲低了MeCP2基因(Figure 2A and 2B),HCT116、RKO、DLD1细胞中过表达MeCP2基因(Figure 2E and 2F)。Transwell实验发现,敲低MeCP2后,细胞的侵袭和迁移能力显著降低(Figure 2C and 2D),相反,过表达MeCP2后,细胞的侵袭和迁移能力显著提高(Figure 2G and 2H)m6A斑点实验和免疫组化实验显示敲低MeCP2基因后细胞m6A整体水平显著上调(Figure 2I and 2J)。相反,过表达MeCP2后,细胞整体m6A水平显著下调(Figure 2K and 2L)。综上,MeCP2抑制CRC细胞的m6A水平。

表观遗传RNA甲基化


三、MeCP2m6A甲基转移酶METTL14相互作用

既然MeCP2m6A有关,那么是哪一个m6A相关的基因与其存在相互作用呢?作者的COIPWB实验发现MeCP2仅与METTL14存在相互作用,而与其他m6A相关酶无互作(Figure 3A -3D)。但是MeCP2、METTL14METTL3之间存在比较复杂的相互作用(Figure 3E)。之后WB实验证实,在293T细胞中,METTL14截断蛋白与MeCP2METTL3相互作用的较低(Figure 3F)。

作为一种内在紊乱的蛋白,MeCP2不能形成稳定的二级结构。作者猜测,这是这种结构的灵活性使MeCP2能够与METTL14相互作用。而接下来的免疫荧光实验发现显示MeCP2METTL14在细胞核内重合(Figure 3G)。同时,MeCP2的过表达影响METTL3的蛋白表达水平,但是却不影响其转录水平的表达(Figure 3H and 3I)

综上,这些结果有力地证实了MeCP2对RNA甲基化的影响依赖于MeCP2和METTL14之间的相互作用。

表观遗传RNA甲基化

表观遗传RNA甲基化

四、METTL14抑制CRC的转移

有研究表明,METTL14可以抑制结肠直肠癌的肿瘤转移。故,作者重点研究METTL14CRC进展和肿瘤发生中的作用。首先,TCGA数据总体生存率分析发现低METTL14的表达与预后较差有关(Figure 4A)。在HCT116RKO细胞中稳定敲低METTL14后,MeCP2的蛋白和mRNA水平并没有明显的改变(Figure 4B - 4D),而METTL3的蛋白水平显著降低(Figure 4B and 4C)Transwell实验证实表观遗传RNA甲基化 - 知乎 (zhihu.com)