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亚硫酸氢盐测序法(BSP)

BSP又称亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR),结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。

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实验介绍

【应用简介】

BSP又称亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR),结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。


【技术原理】

使用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶(C)都被转化为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,经琼脂糖凝胶电泳,将符合预期的产物纯化回收连接T载体,进行阳性克隆测序,即可了解每个CpG位点的甲基化情况。通过统计分析,即可判断某个特定基因特定CpG岛区段内的甲基化程度。


【实验流程】

1、引物设计与测试;

2、基因组提取;

3、亚硫酸氢钠修饰DNA并纯化回收修饰产物;

4、PCR扩增、产物回收并连入T载;

5、测序分析;

6、甲基化分析与数据统计。


案例展示

BSP克隆子的原始测序结果

官网BSP.png

图1  测序结果比对示例



图2  测序结果统计点状图


注:每个圆圈代表一个CG位点,黑圈代表甲基化,白圈代表未甲基化;每一行代表一个样本 TA 克隆的一个测序结果。


图3  各样本基因检测区段组间的甲基化水平差异分析



常见问题

1、怎样确定基因的目标区域来进行甲基化分析呢?

转录起始位点附近的CpG岛进行DNA甲基化分析的首选区域,一般位于启动子或者5‘UTR区。

 

2、  为什么文献报导的甲基化序列不在CpG岛中?

CpG岛是甲基化密集区域,但是没有明显的CpG岛不代表就没有甲基化,甲基化也可能发生在并不密集的CG区域。

 

3、BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序,为什么需要构建TA克隆后测序?

PCR产物是不同样本的混合体,直接用PCR产物测序有可能在原有的C位点得到双峰图,以及由于测序前面一段序列不可靠而影响部分甲基化位点的判读,无法准确地确定甲基化的程度,因此建议进行TA克隆后测序。



送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温





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