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2024-04-24 13:44:53
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2024-04-18 19:19:06
实验介绍
【应用简介】
在细胞实验中，对于按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过使用病毒介导的方式能够大大提高基因的转导效率，达到目的基因高效表达的目的。
具体来说，慢病毒包装主要应用于以下几个方面：
1、对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，极大地方便了RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究；
2、进行稳转细胞株的筛选；
3、为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液。
【技术原理】
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装。包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中。离心收集上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
【实验方法】
1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；
2、细胞转染：取两个EP管，一个加入Opti-MEM、核心质粒和包装质粒；另一个加入Opti-MEM、lipo2000，然后将两管混匀；
3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；
4、收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度检测：细胞为30%－50％时加入病毒上清液，检测阳性细胞比例。
案例展示
慢病毒感染的细胞（左：白光；右：荧光）
技术总结
1、获取的目的基因一定要精确（注：客户提供基因ID）；
2、针对目的基因设计合成shRNA建议设计3对，以保证效果，节省实验周期；
3、要选择符合要求的载体；
4、构建的过慢病毒载体需要经过测序验证；
5、对于测序正确的重组质粒，需要提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；
6、使用高效重组载体和包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装并收集上清液；
7、通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；
8、建议病毒使用前先测定病毒滴度。
送样与交付标准
| 样品类型 | 样品需求 | 保存条件 | 运输条件 | 备注 |
|---|---|---|---|---|
| 冻存细胞 | 1.取对数生长期的细胞，消化离心收集细胞，加入冻存液吹打混匀，装入冻存管，标明细胞名称/细胞代数，冻存细胞数量在1-5*106个/ml。 2.项目启动后细胞复苏，复苏后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 液氮 | 干冰 | 所有样本均须有唯一标记，且标记清晰可识 |
| 复苏后细胞 | 1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上，装满培养液，只留纽扣大小的气泡，瓶口用封口膜封好，标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型，瓶子固定运输。 2.收到细胞后3天反馈细胞状态，3-5天反馈细胞污染情况，5-7天反馈支原体污染情况。 3. 细胞详细信息（名称、培养基和其他培养条件等，如经过特别处理需告知并提供必要的信息） | 常温 | 常温 | |
| 质粒 | 1.纯度高，无内毒素，无蛋白质，基因组DNA/RNA污染，质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间 2.浓度不低于0.5μg/μl，总量大于100μg，无内毒素处理 3. 载体详细信息，包括名称、大小、抗性、荧光标记 | -20℃ | 冰袋 | |
| 病毒 | 1.慢病毒：滴度不低于1*108TU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 2.腺病毒：滴度不低于1*109PFU/ml，体积约200μl，标明制备时间，且没有反复冻融 3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类，最好需要提供病毒载体图谱； | -80℃ | 干冰 |
交付标准：
滴度:>108TU/ml
规格:1ml
赠送阴性对照病毒规格:0.2ml（>108TU/ml）
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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