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酵母双杂交

酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆(融合)到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上,构建成融合表达载体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统。

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实验介绍

【技术原理】

随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展,为适应对众多基因或蛋白进行功能研究的发展趋势,已出现了很多新技术。其中酵母双杂交技术以其简便,灵敏,高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到广泛的应用。


酵母双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。酵母转录因子GAL4含两个结构域:DNA结合功能域和转录激活结构域,前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节基因的上游,后者同转录复合体的其他成分作用,启动相应基因的转录。将编码DNA结合功能域的基因与已知诱饵蛋白质基因构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白,将编码DNA转录激活域的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上,同时将上述两种载体转化改造后的酵母。当两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因,从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来,从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。

酵母双杂交实验原理图


【实验流程】


案例展示


酵母双杂交系统(two-hybrid system)案例一

酵母双杂交系统(two-hybrid system)案例二

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




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