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稳定表达细胞系构建

将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

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2024-04-15 22:57:07

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稳定表达细胞系构建

【应用简介】

稳转株主要应用于以下研究中:

1、需要长期在目的细胞中研究基因功能。通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也方便长期的实验研究;

2、部分蛋白半衰期及长,瞬时RNA只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,通过构建稳定株可以实验更好的基因干扰效果;

3、瞬转会引入不可预期的拷贝数表达(往往瞬时表达较高),导致因为人为因素造成实验结果的不精确,构建稳定株可以帮助筛选到拷贝数适量的细胞进行实验研究;

4、稳转株可以用于诱导表达系统的实验,用于控制基因的时空表达;

5、需要用目的细胞构建动物模型的实验,往往需要构建成稳定株。


【原理介绍】

将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。

慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,因此,慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。


【实验方法】

1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选;

2、目的细胞的合适病毒滴度筛选;

3、慢病毒构建与包装与滴度测定;

4、慢病毒感染;

5、特定抗生素筛选稳转细胞株;

6、稳转细胞株鉴定。

案例展示

稳定表达细胞系构建_副本.png


Hela细胞多克隆稳转细胞株

       多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂,从感染72小时后开始加入筛选药物,每隔2天重新换液加入筛选药物。药物筛选需至少持续14天,直至显微镜下观察到的荧光细胞比例为100%

技术总结

稳转株的构建是一个长时间多平台合作的项目,有多种因素容易导致稳转株构建失败:

1、支原体污染问题

细胞支原体轻度的污染不会影响细胞的增殖和生长,但是在病毒感染后容易大规模爆发,进而导致稳转株构建失败;

2、慢病毒保存不当

3、慢病毒制备好后需及时分装并放置于-80℃保存,避免反复冻融;

4、目的基因表达水平低

5、细胞感染病毒后毒性大导致细胞死亡。

送样与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
冻存细胞

1.取对数生长期的细胞,消化离心收集细胞,加入冻存液吹打混匀,装入冻存管,标明细胞名称/细胞代数,冻存细胞数量在1-5*106个/ml。

2.项目启动后细胞复苏,复苏后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

液氮干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
复苏后细胞

1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上,装满培养液,只留纽扣大小的气泡,瓶口用封口膜封好,标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型,瓶子固定运输。

2.收到细胞后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

常温常温
质粒

1.纯度高,无内毒素,无蛋白质,基因组DNA/RNA污染,质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间

2.浓度不低于0.5μg/μl,总量大于100μg,无内毒素处理

3. 载体详细信息,包括名称、大小、抗性、荧光标记

-20℃冰袋
病毒

1.慢病毒:滴度不低于1*108TU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

2.腺病毒:滴度不低于1*109PFU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类,最好需要提供病毒载体图谱;

-80℃干冰




细胞交付标准.jpg