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co-IP免疫共沉淀/(Co-IP-WB/Co-IP-MS)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

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实验介绍

【实验介绍】

   Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用,是IP实验的一种扩展, 基于IP反应的潜力,在样品溶液中捕获和纯化主要目标(抗原等)及通过天然相互作用靶标结合的其他的大分子。此外,还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。
   CO-IP的应用场景主要是:
   1、用于研究蛋白质复合体成分(通过IP级抗体直接捕获目的蛋白族群,或通过构建带标签的目的蛋白融合表达载体并通过标签蛋白的IP抗体进行免疫捕获。常与western blot和蛋白质谱联用进行IP产物分析)。

   2、用于检测生理状态下存在的蛋白质互作关系。

   3、 用于检测蛋白质的修饰状态,如泛素化。

【技术原理】

免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein G或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的Protein G或A,若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白,就可以形成蛋白复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein G或A”;最后通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。


【实验流程】


CO-IP实验流程图.png

案例展示


技术总结


【技术总结】

  1、实验样品制备方法准备:很重要!根据研究目的,检测样品可能是组织样品,也可能是细胞样品,不同样品制备流程不太相同,目的蛋白表达量也有较大差别,必须选择合适的样品和样品制备方法。

  2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体:非常重要!用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体,最理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体,且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖,比普通WB抗体要求高出很多;同时,抗体特异性和灵敏性尽可能高,才有可能有干净的背景和较好的IP效果,所以必须选择最适合的抗体用于Co-IP实验。


【注意事项】

1、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP-40 或 Triton- X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定;

2、不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂;

3、使用对照抗体:单克隆抗体:正常小鼠的 IgG 或另一类单抗;兔多克隆抗体:正常兔 IgG;

4、确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

5、要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

6、确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




细胞交付标准.jpg