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CCK8/mtt/细胞增殖检测

MTT,CCK-8,BrdU,EdU等方法是常见的细胞增殖检测技术,分别从代谢活性和DNA合成的角度来反应细胞的增殖情况。MTT和CCK-8检测原理为活细胞线粒体中的一些脱氢酶能使检测试剂还原为甲瓒,而死细胞无此功能。BrdU和EdU则能都在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子,通过基于与荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性。

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实验介绍

【应用简介】

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础,与细胞凋亡、细胞周期等是肿瘤研究的重要表型,同时也是分子生物学和药理学研究的重要内容。MTT或CCK8是检测细胞增殖的常用手段,可研究药物对细胞的毒性作用;或探究过表达或干扰细胞中某个基因对细胞增殖能力的影响,为进一步研究基因的功能提供依据等。


【MTT技术原理】

MTT(噻唑蓝),可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒体中的脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶并沉积在细胞中,而死细胞无此功能;结晶物能溶于DMSO中,通过酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,间接反映活细胞数量(一定范围内,OD值越大,细胞活性越强)。


【CCK8技术原理】

 CCK-8试剂中的WST-8,可在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物;用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞量(一定范围内生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比)。


【实验方法】

Step1:细胞培养及状态调整;


Step2:铺板;

Step3:过夜培养,待细胞贴壁及稳定;

Step4:药物处理;

Step5MTT呈色:避光加MTT溶液,37℃孵育4 h,孵育完成后除尽孔内上清,每孔加150μL DMSO,振荡10min

             CCK-8呈色:避光加CCK-8溶液,孵育37℃ 1-4 h;

Step6:上机检测:MTT-490nm;CCK8-450nm;

Step7:分析数据:以OD值或细胞相对存活率作图。

注:如研究某基因对细胞增殖能力的影响,采取先转染后铺板的原则。



案例展示


案例一:细胞相对存活率%

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注:相对存活率%=(实验组OD值-调零孔OD值)/(空白组OD值-调零孔OD值)×100

       *表示实验组与其对照组比较差异显著( 0.01<P<0.05)

      **表示实验组与其对照组比较差异极显著(P<0.01)

结果分析:

1、空载对照组与空白组无显著差异,表明载体正常,对细胞增殖无明显影响。

2、过表达X基因可促进目的细胞的增殖,与对照组相比差异显著。


案例二:IC50:指某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(如酶、细胞受体、微生物)的半量,即50%抑制浓度。

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结果分析:

1、当A药物处理目的细胞24h时,药物的半数抑制浓度为31.39μg/mL;

2、当A药物处理目的细胞48h时,药物的半数抑制浓度为9.98μg/mL


技术总结

【常见问题及注意事项】

1、铺板密度不合理,均匀度不一致;

2、实验分组不严谨;

3、实验设置时间点不合理;

4、MTT或CCK8加样时注意事项不明确;

5、血清等影响:高浓度血清或药物颜色会影响试验孔的吸光度值;

6、边缘效应:边缘孔的水分挥发较快,药物易被浓缩。


送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
冻存细胞

1.取对数生长期的细胞,消化离心收集细胞,加入冻存液吹打混匀,装入冻存管,标明细胞名称/细胞代数,冻存细胞数量在1-5*106个/ml。

2.项目启动后细胞复苏,复苏后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

液氮干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
复苏后细胞

1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上,装满培养液,只留纽扣大小的气泡,瓶口用封口膜封好,标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型,瓶子固定运输。

2.收到细胞后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

常温常温
质粒

1.纯度高,无内毒素,无蛋白质,基因组DNA/RNA污染,质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间

2.浓度不低于0.5μg/μl,总量大于100μg,无内毒素处理

3. 载体详细信息,包括名称、大小、抗性、荧光标记

-20℃冰袋
病毒

1.慢病毒:滴度不低于1*108TU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

2.腺病毒:滴度不低于1*109PFU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类,最好需要提供病毒载体图谱;

-80℃干冰




细胞交付标准.jpg