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定点突变

目前,由PCR介导的定点突变相比于其他突变技术具有周期短、成功率高、不受酶切位点限制等优点,是使用最普遍的定点突变方法。

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2024-05-22 01:25:04

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2024-05-21 13:25:59

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2024-05-18 20:00:25

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实验介绍

【技术原理】

DNA分子中由于发生碱基对的增添、缺失或改变进而引起基因结构的改变,称为基因突变。定点突变 (mutagenesis)是通过PCR等方法向目的DNA片段中引入突变,包括碱基的添加、删除、点突变等。该技术能迅速、高效地改变DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具,也是研究人员在实验室中改造、优化基因常用的一种非常有用的手段。目前,由PCR介导的定点突变相比于其他突变技术具有周期短、成功率高、不受酶切位点限制等优点,是使用最普遍的定点突变方法。


【实验流程】

定点突变.png

案例展示


常见问题

常见问题1:质粒模板无法正常扩增

可能原因及解决方法:

(1)引物设计有误:核对引物设计方案;

(2)扩增体系配制错误:重复实验;

(3) 扩增反应条件不优化:调整Mg浓度、酶量、扩增程序;

(4)模板质粒质量偏差:长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,应使用新鲜制备的质粒作为模板。

 

常见问题2:平板上长不出克隆或克隆数目很少

可能原因及解决方法:

(1)感受态效率低:使用新制备或妥善冻存的感受态细胞,确保转化效率>cfuμg。每次可设置一组转化质粒的对照实验,以检测感受态细胞的转化效率;

(2)重组反应体系中DNA量不足,或者比例不佳(双碱基突变):尽量按照推荐DNA的量配制反应体系;

(3) 重组环化反应体系中DNA不纯,抑制反应:未纯化DpnI消化产物加入重组反应体系内的总体积不应超过μl(反应体系体积)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化;

(4)感受态细胞中加入了过多的反应产物:反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的,否则会降低转化效率;

(5)出现转化抑制效应:当转化的DNA浓度太高时,会抑制转化反应。将重组反应产物稀释倍后取进行转化。

 

常见问题3:定点突变未正确完成

可能原因及解决方法:

(1)引物设计错误:核对引物设计方案;

(2)扩增反应所用模板为非甲基化的质粒:DpnI只能识别甲基化DNA,请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板;

(3)扩增反应使用过多的模板质粒:对于大多数质粒,ng模板量已足以使扩增反应正常进行,过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全,降低突变成功率。

 

常见问题4:非目标位点突变

可能原因及解决方法:

(1)模板质粒携带未知位点突变:测序确认模板质粒序列正确性。

(2)扩增循环数过多:为了防止扩增过程中引入非目标突变,扩增循环数不宜超过30。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应不超过35。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




细胞交付标准.jpg