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原位杂交

原位杂交(in situ hybridization)是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞等样本中待测目的基因按碱基配对原则进行特异性结合而形成的杂交体,然后再用与标记物相应的检测方法。

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实验介绍

【技术原理】

原位杂交(in situ hybridization)是应用已知碱基顺序并带有标记的核酸探针与组织、细胞等样本中待测目的基因按碱基配对原则进行特异性结合而形成的杂交体,然后再用与标记物相应的检测方法,在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,从而在显微镜下进行目的基因的定位检测观察。主要检测方法分为DAB显色和荧光显色两种。


【实验流程】


原位杂交.png

案例展示


原位杂交_终.jpg


组织的miRNA原位杂交

技术总结

【常见问题】

1、RNA探针长度以50-150bp为佳,探针已进入细胞,杂交率高,杂交时间短。

2、原位杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度,探针浓度必须给予该实验最大信噪比,因为背景着色度高低与探针浓度有关。

3、杂交温度应低于解链或溶解温度20-30℃。杂交反应的时间可随探针浓度的增加而缩短,杂交时间过短会造成杂交不完全,杂交时间过长会增加非特异性着色。

4、组织固定或蔗糖脱水不好会使组织有较多的空泡。



【注意事项】

1、固定液的选择及固定时间

     石蜡组织建议用10%中性缓冲福尔马林(含1/1000 DEPC)固定1~24h,其它固定液对实验结果可能产生一定的影响。

2、组织切片和载玻片的选择

     组织切片4~5μm 厚,过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响,而且切片应完整,质量良好,否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片,有条件的可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片,可有效防止脱片现象的发生。

3、实验过程中切片的预处理

   切片预处理过程包括煮沸处理和蛋白酶消化。当组织处理不规范、切片过厚或烤片不足时,在煮沸过程中容易掉片,建议烤片温度在56℃过夜。煮沸过程中要严格控制实验温度和时间。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
新鲜组织新鲜取材组织,用 PBS 清洗干净血液等,立即-80℃保存-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
一般固定组织一般组织体积不超过2cmX2cmX0.5cm,固定时尽量保持组织的原有形态并清理干净血液及多余部分,如肠道内容物;固定液体积为组织大小的10倍以上,容器足够容纳组织不使其挤压变形。标注好固定液类型和固定时长常温常温
特殊固定组织睾丸、眼球、脊髓、肌肉等组织:推荐使用对应的特殊固定液进行固定,以保证固定效果。如Bouin液,适用于睾丸组织、皮肤组织及眼球的固定

组织蜡块组织由标准的石蜡包埋盒包埋(尺寸为30*24*7mm),石蜡与组织要均匀接合,不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定,有效厚度至少要超过 0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块,超过半年的蜡块抗原可能丢失,做免疫组化可能出现检测不到蛋白。常温常温
组织切片需用防脱载玻片进行捞片,并注明切片厚度、已烤片温度与时间,组织应在靠近切片下端 1/3 处。4℃冰袋
细胞爬片使用 12 孔板或 24 孔板专用细胞爬片,细胞爬片经固定后用 PBS 洗涤 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每个爬片在孔板盖上应有唯一的标记,并有电子版的分组信息,以防标记在运输途中模糊。常温常温
植物样本新鲜组织FAA固定,木质化程度不高;对于较薄的叶片,如果要求平行叶片切片,难以保证切完整;根茎要求直径>1mm常温常温
抗体保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,并附带说明书,抗体的量应大于实验所需的量。组织切片、组织芯片按稀释后 100μl 一张切片计算抗体用量, 24 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 200μl 一张计算抗体用量,12 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 400μl 一张计算抗体用量。-20℃冰袋或干冰




病理交付标准.jpg