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细胞焦亡

细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经性疾病和动脉粥样性疾病等的发生发展,并发挥重要作用。对细胞焦亡的深入研究,有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。

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实验介绍

【应用简介】

细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经性疾病和动脉粥样性疾病等的发生发展,并发挥重要作用。对细胞焦亡的深入研究,有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。


【原理介绍】

细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式,其特征为依赖于半胱天冬酶-1(caspase-1),并伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。研究表明,细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展,并发挥重要作用,对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用,为临床防治提供新思路。


细胞焦亡的检测方法:

1、形态变化

1.1 扫描电镜观察细胞形态;

1.2 TUNEL染色;

1.3 免疫荧光染色(GSDMD/GSDME);


2、检测焦亡相关蛋白

2.1 q-PCR/Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平;

2.2 ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-18等炎症因子的水平;

2.3 MTT法测定细胞活力。

实验方法及案例展示

案例一 细胞焦亡与感染性疾病


3.png

Yu-Lei Gao,et al,Mediators of Inflammation. 2018

在病原体感染时,适度的细胞焦亡可清除致病微生物,而过度的细胞焦亡在导致细胞死亡的同时,释放炎症因子,扩大炎症反应,造成发热,低血压、败血症等症状。以败血症为例,败血症是由致病菌侵入血液系统,并在其中生长繁殖,产生毒素,引起全身性感染,最新研究表明,细胞自噬相关基因Atg7沉默后,可激活细胞焦亡途径。


案例二 细胞焦亡与代谢性疾病


4.png

Beibei Luo,et al,frontiers in psychology.2017.

因代谢障碍或代谢旺盛等原因引起的疾病称为代谢性疾病,常见的有糖尿病、痛风、糖尿病性心肌病等。以糖尿病性心肌病为例,由心肌细胞死亡引起,最新的研究显示高血糖可以造成活性氧的产生增加,进而上调NF-κB和TXNIP,NF-κB又可以上调NLRP3、IL-1β前体以及IL-18前体的表达;TXNIP通过改变NLRP3的结构激活Caspase-1,活化的Caspase-1一方面切割Gasdermin D,形成含有Gasdermin D氮端活性域的肽段,诱导心肌细胞膜穿孔、破裂,释放内容物,引起炎症反应;另一方面,活化的Caspase-1对IL-1β和IL-18的前体进行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并释放到胞外,募集炎症细胞聚集,扩大炎症反应。


案例三 细胞焦亡与神经系统疾病


5.png

Tan et al. Journal of Neuroinflammation(2015) 12:18

神经系统疾病包括脑损伤,癫痫等。以癫痫为例,研究发现,癫痫发作可通过钾离子外流等途径激活NLRP1炎症体,进而激活依赖Caspase-1的焦亡途径,导致癫痫进一步发展。

技术总结

细胞焦亡.png

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
冻存细胞

1.取对数生长期的细胞,消化离心收集细胞,加入冻存液吹打混匀,装入冻存管,标明细胞名称/细胞代数,冻存细胞数量在1-5*106个/ml。

2.项目启动后细胞复苏,复苏后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

液氮干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
复苏后细胞

1.使用T25培养瓶运输。细胞汇合度达到60%以上,装满培养液,只留纽扣大小的气泡,瓶口用封口膜封好,标明细胞名称/细胞代数/接种时间/培养基类型,瓶子固定运输。

2.收到细胞后3天反馈细胞状态,3-5天反馈细胞污染情况,5-7天反馈支原体污染情况。

3. 细胞详细信息(名称、培养基和其他培养条件等,如经过特别处理需告知并提供必要的信息)

常温常温
质粒

1.纯度高,无内毒素,无蛋白质,基因组DNA/RNA污染,质粒A260:A280的比值在1.8-2.0之间

2.浓度不低于0.5μg/μl,总量大于100μg,无内毒素处理

3. 载体详细信息,包括名称、大小、抗性、荧光标记

-20℃冰袋
病毒

1.慢病毒:滴度不低于1*108TU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

2.腺病毒:滴度不低于1*109PFU/ml,体积约200μl,标明制备时间,且没有反复冻融

3.明确是否表达荧光标签蛋白及其种类,最好需要提供病毒载体图谱;

-80℃干冰