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考马斯亮蓝染色

考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速,常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢,但是可以被洗脱下去,所以可以用来对病理组织内的蛋白质进行染色。

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实验介绍

【实验原理】

考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。


【实验方法】

Step1石蜡切片常规操作脱蜡水化;

Step2:切片复水后经过7%(v/v)醋酸1~2min

Step3:放入考马斯蓝R染色液中染色15min

Step4:自水清洗5min后经过蒸馏水;

Step5:水:依次经85%、95%Ⅰ、95%Ⅱ10秒,无水乙醇Ⅰ30s、无水乙醇Ⅱ1min

Step6:透明:经二甲苯Ⅰ1min、二甲苯Ⅱ2min;

Step7:中性树胶固封,镜检。


案例展示

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技术总结

【常见问题】

1、染色时间过长或过短导致的染色过深或过浅;

2、分化液分化时间过长,导致组织染色阳性过浅;

3、特殊组织如植物组织较脆,易出现掉片。


【注意事项】

1、控制染色时间,保证染色不至于过深或过浅,必要时可在显微镜下观察控制染色时间;

2、分化时间不易过长,保证阳性显色清晰可见;

3、特殊组织切片时应控制切片厚度以及摊片时间,减少掉片风险。


送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
新鲜组织新鲜取材组织,用 PBS清洗干净血液等,立即-80℃保存;-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识。
一般固定组织一般组织体积不超过2cmX2cmX0.5cm,固定时尽量保持组织的原有形态并清理干净血液及多余部分,如肠道内容物;固定液体积为组织大小的10倍以上,容器足够容纳组织不使其挤压变形。标注好固定液类型和固定时长;常温常温
特殊固定组织睾丸、眼球、脊髓、肌肉等组织:推荐使用对应的特殊固定液进行固定,以保证固定效果。如Bouin液,适用于睾丸组织、皮肤组织及眼球的固定;

组织蜡块组织由标准的石蜡包埋盒包埋(尺寸为30*24*7mm),石蜡与组织要均匀接合,不能有裂痕;蜡块厚度根据所需切片的数量而定,有效厚度至少要超过0.1cm。尽量提供半年内的组织蜡块,超过半年的蜡块抗原可能丢失,做免疫组化可能出现检测不到蛋白;常温常温
组织切片需用防脱载玻片进行捞片,并注明切片厚度、已烤片温度与时间,组织应在靠近切片下端 1/3 处;4℃冰袋
细胞爬片使用 12 孔板或 24孔板专用细胞爬片,细胞爬片经固定后用 PBS 洗涤 2~3 次,保存在 PBS 中,用封口膜密封孔板。每个爬片在孔板盖上应有唯一的标记,并有电子版的分组信息,以防标记在运输途中模糊;常温常温
植物样本新鲜组织FAA固定,木质化程度不高;对于较薄的叶片,如果要求平行叶片切片,难以保证切完整;根茎要求直径>1mm;常温常温
抗体保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,并附带说明书,抗体的量应大于实验所需的量。组织切片、组织芯片按稀释后 100μl 一张切片计算抗体用量, 24 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 200μl一张计算抗体用量,12 孔板细胞爬片圆形盖玻片按稀释后 400μl 一张计算抗体用量。-20℃冰袋或干冰


病理交付标准.jpg