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RIP检测

核酸和蛋白质是组成生命的主要物质,研究细胞内RNA与蛋白结合情况,可以了解转录后调控网络的动态过程,帮助我们发现的miRNA的的的的的调节靶点,RIP检测实验是应用于蛋白与RNA互作关系的重要参考。

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实验介绍

【应用简介

核酸和蛋白质是组成生命的主要物质,研究细胞内RNA与蛋白结合情况,可以了解转录后调控网络的动态过程,帮助我们发现的miRNA的调节靶点,RIP检测实验是应用于蛋白与RNA互作关系的重要参考。


【技术原理图】

【实验方法】

第一步:细胞裂解液的制备

第二步:磁珠与抗体的准备

第三步:RNA结合蛋白免疫沉淀

第四步:用蛋白酶ķ对RNA-蛋白复合物进行消化

第五步:RNA纯化

第六步:对结合在复合物上的RNA反转录,合成cDNA

第七步:Q-PCR验证RNA

案例展示

技术总结

【常见问题】

1、经过免疫沉淀后的RNA浓度过低;

2、Input组目的条带无扩增;

3、RNA纯度未在1.8-2.1之间;

4、阴性对照IgG反应中有目的条带。

 

【注意事项】

1、RIP反应体系中的试剂和抗体中均需保证无RNA酶;

2、细胞样本的数量较大,应按照所需要求提供细胞样本数量;

3、选购的相应的抗体应达到IP实验级别,并通过阴性实验反馈结果可信性。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温




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