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外泌体提取

外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡,具有典型的脂质双分子层结构;存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中;外泌体携带有多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息,不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用,更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

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2024-05-21 23:05:47

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2024-05-18 08:50:49

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实验介绍

【技术原理】

基于SEC+超滤的外泌体分离方法,可方便快捷进行高纯度及高回收率的外泌体分离。以荧光外泌体作为标准品,Exosupur可回收94.87%的荧光外泌体;能够去除99.44%的血浆游离杂蛋白,如主要的miRNA结合蛋白Ago、血浆杂蛋白HASExosupur中更少;跟超离及市面常见试剂盒相比,该方法提取的外泌体的particle数与蛋白含量比值更高,表明分离得外泌体纯度更高,杂蛋白含量更低。


此方法可以得到更高丰度的长链RNA,在外泌体lncRNA含量较低的情况下,更有利于mRNA +LncRNA的研究;Exosupur富集到的外泌体更纯,能更准确地分析外泌体来源miRNA


通过酶消化试验,证明得到的RNA更多的是来源于囊泡,而非游离RNA

案例展示


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技术总结

【注意事项】

1、根据样本的不同,选用不同的外泌体提取方法;

2、避免外泌体中内容物降解好变性,所有操作尽量在4℃条件下进行;

3、避免外泌体膜结构破坏,操作中尽量减少外泌体的压力和剪切力,比如使用钝化的枪头等。

送检与交付标准

【送检标准】

(一)、血浆样本采集

1、请用EDTA抗凝管采集患者血液(a),若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过4 h);

2、将采集到的血液在4℃1500g,离心20min,去除血液中的细胞;

3、取上清,4℃3000g,离心15min,收集上清(血浆),-80℃保存。

4、送样量: 排阻+超滤      4mL(够2次分离)

            超离      4mL

注意事项:① 请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放;② 请排除乙肝病毒,HIV等病毒感染样本。


(二)、血清样本采集

1、请用EDTA抗凝管采集患者血液(a),若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过4 h);

2、将采集到的血液在4℃1500g,离心20min,去除血液中的细胞;

3、取上清,4℃13000g,离心2min,收集上清(血清),-80℃保存。

4、送样量:       超离      4 mL

                排阻+超滤      1mL

注意事项:请排除乙肝病毒,HIV等病毒感染样本。


(三)、尿液样本采集

1、采集前/中后段晨尿约60mL,若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过8 h);

2、将采集到的尿液在4℃下(室温亦可)离心2000g20min,去除尿液中的细胞;-80℃保存;

3、送样量:60 mL

注意事项:请务必嘱咐患者,①采集晨尿,或6 h以上未排尿亦可;②中段尿请务必去掉最初排出的50-80 mL尿液;③女性受试者,请于采尿前对外阴进行清洗。


(四)、胸水样本采集

1、临床收集胸水后若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过8 h);

2、将收集到的胸水1000g 离心10min,收集上清液;

3、将得到的胸水上清3000g 离心10min,收集上清,-80℃保存。

4、送样量:30 mL


(五)、腹水样本采集

1、临床收集腹水后若不能第一时间处理,请于4℃临时保存(不得超过8 h);

2、将采集到的腹水在4℃下(室温亦可)离心2000 g,20 min,去除腹水中的残渣;-80℃保存;

3、送样量:30 mL


(六)、脑脊液样本采集

1、采集方式为腰椎穿刺,样本一经分离,请务必立即置于冰上或4℃短暂保存(不得超过4 h),采样时注意避免血液污染;

2、样本室温下2000g 离心20min去除细胞及部分碎片,取上清,-80℃保存;

3、送样量:5 mL

注意事项:请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放。


(七)、胆汁样本采集

1、用无菌容器收集胆汁;

2、将收集到的胆汁在4℃下,3000g 离心10min 去除细胞沉渣和碎片;

3、收集胆汁上清液,4℃或者-20℃长期保存;

4、送样量:5 mL


(八)、细胞样本采集

对于耐受无血清培养的细胞的处理流程:

1、细胞培养:对于贴壁细胞汇合密度在70%以上,用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清,添加无血清培养基,继续培养24小时;

2、上清收集:细胞上清先用200-300g 离心10min,再用3000g 离心10min,最后0.22um过膜或者10000g 离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩(详见参考文献2.1);

3、储存运输:将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶,-80保存或者干冰运输,体积需求细胞上清原液大于200ml(对应于10cm的大皿,至少需要20大皿);

4、对于一些状态良好的细胞上清,少至70ml也可以得到较好的外泌体分离结果。


对于不耐受无血清培养的细胞的处理流程:

1、细胞培养:对于贴壁细胞汇合密度在70%以上,用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清,添加含5%无外泌体血清的培养基,继续培养24小时;

2、上清收集:细胞上清先用200-300g 离心10min,再用3000g 离心10min,最后0.22um 过膜或者10000g 离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩(详见参考文献2.1);

3、储存运输:将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶,-80保存或者干冰运输,体积需求细胞上清原液大于200ml(对应于10cm的大皿,至少需要20大皿);

4、对于一些状态良好的细胞上清,少至70ml,也可以得到较好的外泌体分离结果。

5、送样量:细胞上清原液建议大于200 mL

注:细胞上清样本按照送样体积收费,超滤浓缩步骤可选择自己完成也可直接送公司完成。

参考文献:Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25


【交付标准】


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