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2024-04-21 20:28:29
实验介绍
【技术原理】
基于SEC+超滤的外泌体分离方法，可方便快捷进行高纯度及高回收率的外泌体分离。以荧光外泌体作为标准品，Exosupur可回收94.87%的荧光外泌体；能够去除99.44%的血浆游离杂蛋白，如主要的miRNA结合蛋白Ago、血浆杂蛋白HAS在Exosupur中更少；跟超离及市面常见试剂盒相比，该方法提取的外泌体的particle数与蛋白含量比值更高，表明分离得外泌体纯度更高，杂蛋白含量更低。
此方法可以得到更高丰度的长链RNA，在外泌体lncRNA含量较低的情况下，更有利于mRNA +LncRNA的研究；Exosupur富集到的外泌体更纯，能更准确地分析外泌体来源miRNA。
通过酶消化试验，证明得到的RNA更多的是来源于囊泡，而非游离RNA。
案例展示
技术总结
【注意事项】
1、根据样本的不同，选用不同的外泌体提取方法；
2、避免外泌体中内容物降解好变性，所有操作尽量在4℃条件下进行；
3、避免外泌体膜结构破坏，操作中尽量减少外泌体的压力和剪切力，比如使用钝化的枪头等。
送检与交付标准
【送检标准】
（一）、血浆样本采集
1、请用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；
2、将采集到的血液在4℃下1500g，离心20min，去除血液中的细胞；
3、取上清，4℃下3000g，离心15min，收集上清（血浆），-80℃保存。
4、送样量： 排阻+超滤 4mL（够2次分离）
超离 4mL
注意事项：① 请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放；② 请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。
（二）、血清样本采集
1、请用EDTA抗凝管采集患者血液（a），若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过4 h）；
2、将采集到的血液在4℃下1500g，离心20min，去除血液中的细胞；
3、取上清，4℃下13000g，离心2min，收集上清（血清），-80℃保存。
4、送样量： 超离 4 mL
排阻+超滤 1mL
注意事项：请排除乙肝病毒，HIV等病毒感染样本。
（三）、尿液样本采集
1、采集前/中后段晨尿约60mL，若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将采集到的尿液在4℃下（室温亦可）离心2000g，20min，去除尿液中的细胞；-80℃保存；
3、送样量：60 mL。
注意事项：请务必嘱咐患者，①采集晨尿，或6 h以上未排尿亦可；②中段尿请务必去掉最初排出的50-80 mL尿液；③女性受试者，请于采尿前对外阴进行清洗。
（四）、胸水样本采集
1、临床收集胸水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将收集到的胸水1000g 离心10min，收集上清液；
3、将得到的胸水上清3000g 离心10min，收集上清，-80℃保存。
4、送样量：30 mL
（五）、腹水样本采集
1、临床收集腹水后若不能第一时间处理，请于4℃临时保存（不得超过8 h）；
2、将采集到的腹水在4℃下（室温亦可）离心2000 g，20 min，去除腹水中的残渣；-80℃保存；
3、送样量：30 mL。
（六）、脑脊液样本采集
1、采集方式为腰椎穿刺，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4℃短暂保存（不得超过4 h），采样时注意避免血液污染；
2、样本室温下2000g 离心20min去除细胞及部分碎片，取上清，-80℃保存；
3、送样量：5 mL。
注意事项：请勿使用含肝素抗凝剂的采样管收集盛放。
（七）、胆汁样本采集
1、用无菌容器收集胆汁；
2、将收集到的胆汁在4℃下，3000g 离心10min 去除细胞沉渣和碎片；
3、收集胆汁上清液，4℃或者-20℃长期保存；
4、送样量：5 mL。
（八）、细胞样本采集
对于耐受无血清培养的细胞的处理流程：
1、细胞培养：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加无血清培养基，继续培养24小时；
2、上清收集：细胞上清先用200-300g 离心10min，再用3000g 离心10min，最后0.22um过膜或者10000g 离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩（详见参考文献2.1）；
3、储存运输：将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于200ml（对应于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。
对于不耐受无血清培养的细胞的处理流程：
1、细胞培养：对于贴壁细胞汇合密度在70%以上，用PBS洗涤细胞2-3遍去除残留牛血清，添加含5%无外泌体血清的培养基，继续培养24小时；
2、上清收集：细胞上清先用200-300g 离心10min，再用3000g 离心10min，最后0.22um 过膜或者10000g 离心30min。将处理后的细胞上清经100kd超滤管超滤浓缩（详见参考文献2.1）；
3、储存运输：将处理好的细胞上清收集在无菌培养瓶，-80保存或者干冰运输，体积需求细胞上清原液大于200ml（对应于10cm的大皿，至少需要20大皿）；
4、对于一些状态良好的细胞上清，少至70ml，也可以得到较好的外泌体分离结果。
5、送样量：细胞上清原液建议大于200 mL。
注：细胞上清样本按照送样体积收费，超滤浓缩步骤可选择自己完成也可直接送公司完成。
参考文献：Rong Xu, David W. Greening , Alin Rai, Hong Ji, Richard J. Simpson. Highly-purified exosomes and shed microvesicles isolated from the human colon cancer cell line LIM1863 by sequential centrifugal ultrafiltration are biochemically and functionally distinct. Methods. 2015 .1;87:11-25
【交付标准】
电话：400-691-6686
在线时间：8:00-24:00
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