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DNA甲基化检测

DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制,DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中,甲基化的状态并不是一成不变,肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系,DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

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实验介绍

【技术原理】

DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制,DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中,甲基化的状态并不是一成不变,肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系,DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。


甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

Herman 等( 1996 )在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高,主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。 

特点:适用范围广,能够检测特异位点是否发生甲基化。



亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)

亚硫酸氢盐修饰后测序法( BSP ) Frommer 等( 1992 )提出的研究 DNA 甲基化方法,此方法可靠性及精确度高,能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化,称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点:精确度高,能够准确检测出甲基化的程度百分比。


【实验流程】


甲基化.png




案例展示

甲基化_副本_副本.png

常见问题

1、怎样确定基因的目标区域来进行甲基化分析呢?

转录起始位点附近的CpG岛进行DNA甲基化分析的首选区域,一般位于启动子或者5‘UTR区。

 

2、为什么文献报导的甲基化序列不在CpG岛中?

没有明显的CpG岛不代表就没有甲基化,甲基化也可能发生在并不密集的CG区域。

 

3、BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序,为什么需要构建TA克隆后测序?

如果进行PCR产物测序就有可能在原有的C位点得到双峰图,无法确定甲基化的程度。

送检与交付标准

样品类型样品需求保存条件运输条件备注
动物组织单个样品>0.1g,2mlEP管或冻存管装,不要过量;样本应尽量新鲜,如不能立即提取蛋白或核酸,应液氮速冻后冻存于-80℃或更低,冻存样本避免反复冻融以致降解-80℃干冰所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识
种子样本去壳新鲜或保存于液氮中的的种子样本,单个样品>0.2g。-80℃干冰
贴壁/悬浮细胞

1. 总RNA或蛋白:106cell/指标、浆/核RNA或蛋白:107cell/指标、线粒体RNA或蛋白:2*107     cell/指标,样本尽量新鲜,细胞收取后直接加Trizol(QPCR检测)或直接冻存于-80℃       

2. 若细胞处理(加药、转染、感染)后状态差应酌情加大收样量

-80℃干冰
全血/血清样品用抗凝管保存的外周血 5~10ml,骨髓 1~3ml; -80℃保存不超半周的白细胞匀浆>400μl,每 400μl 加入 400μl Trizol。-80℃干冰
石蜡包埋样品由标准的石蜡包埋盒包埋的石蜡块,有效厚度大于 0.1cm; 新鲜的 FFPE 组织切片,每片厚度不超过 10μm,2~8 张,表面积不超过 250mm2。-20℃冰袋
抗体

1. 按样本种属提供满足相应实验要求的抗体;

2. 按抗体说明书要求寄送,尽量避免分装;如分装,确保量足够进行实验,并提供抗体说明书。

3.保存抗体的抗体管上应有能够识别此抗体的标记,抗体的量应大于实验所需的量。

-20℃冰袋
引物干粉,≥1OD,如进行预实验,每个基因至少提供两对引物, 附带公司引物合成单。-20℃冰袋或常温





细胞交付标准.jpg