ChIP 实验 protocol 下载：标准流程 + 常见问题解决

前两篇我们总结了chip实验中ChIP-seq 与 ChIP 实验的区别、chip实验重复性差等常见问题，今天来学习chip实验操作时最容易碰见一些问题吧，希望大家引以为鉴，能够避免这些普拉特泽为大家踩过的坑。

上篇：ChIP-seq 与 ChIP 实验的区别，一篇文章讲清楚

中篇：ChIP 实验重复性差？教你 3 个提高实验稳定性的秘诀

链接奉上，大家快点踩着普拉特泽的肩膀去摘苹果吧！那现在我们来接着总结：

一、ChIP实验标准操作流程

1. 实验前准备

关键试剂与设备

抗体：验证过的ChIP级抗体（建议查阅CiteAb或厂商验证数据）
交联试剂：1%甲醛（活细胞）或DSG+甲醛（难交联蛋白）
超声破碎仪：确保DNA片段化至200-500bp（关键步骤！）
磁珠：Protein A/G磁珠（根据抗体宿主物种选择）

样本处理注意事项

细胞量：通常需1×10^6~1×10^7个细胞/IP
交联时间：甲醛10-15分钟（过长会导致抗原遮蔽）
终止交联：用125mM甘氨酸淬灭10分钟

2. ChIP实验详细步骤

Step 1: 染色质片段化

超声条件优化：

使用Bioruptor或Covaris超声仪
输出功率：30%振幅，30s ON/30s OFF，循环6-8次
关键验证：跑胶检测片段大小（目标200-500bp）

Step 2: 免疫沉淀（IP）

抗体用量：1-5μg/IP（需预实验优化）
孵育条件：4℃旋转过夜（避免非特异性结合）
洗涤缓冲液：

Low Salt Wash Buffer (150mM NaCl)
High Salt Wash Buffer (500mM NaCl)
LiCl Wash Buffer (250mM LiCl)

Step 3: 解交联与DNA纯化

解交联：65℃ 4-6小时（含蛋白酶K）
纯化：酚-氯抽提或商用DNA纯化试剂盒

Step 4: 数据分析

qPCR验证：设计目标区域引物（阳性/阴性对照必需）
测序准备：文库构建适用于ChIP-seq

二、ChIP实验常见问题与解决方案

问题1：信号弱或无富集

可能原因：

• 抗体效率低（解决方案：使用ChIP验证过的抗体，如Abcam的"ChIP+")

• 交联不足（解决方案：尝试DSG+甲醛双交联）

• 片段化不完全（解决方案：优化超声条件，检测片段大小）

问题2：高背景噪音

可能原因：

• 非特异性抗体结合（解决方案：增加预清除步骤，使用IgG对照）

• 洗涤不彻底（解决方案：增加High Salt Wash次数）

问题3：DNA片段过大或过小

• 片段>1000bp：超声功率不足（增加振幅或时间）

• 片段<200bp：过度超声（减少超声循环次数）

问题4：qPCR无扩增

• DNA损失：检查纯化步骤，换用柱式纯化试剂盒

• 引物设计问题：确保靶区域包含预测结合位点

三、高阶技巧：如何提升ChIP成功率？

1. 阳性/阴性对照必做：

◦ 阳性对照：已知结合位点（如GAPDH启动子）

◦ 阴性对照：非目标区域（如基因沙漠区）

2. 多抗体验证：尤其对新靶点，建议尝试2-3种不同抗体

3. 超声校准：每次实验前用标准DNA样本校准仪器

四、ChIP实验方案优化案例

案例：某团队研究转录因子NF-κB在炎症反应中的结合位点，初始ChIP失败。通过：

1. 改用DSG+甲醛双交联

2. 优化超声至300-500bp片段

3. 增加High Salt Wash至3次

最终获得高信噪比数据，成果发表于《Nucleic Acids Research》

如果你总是在做实验时总会遇上这样那样的问题需要帮助时，请记得在ChIP 实验中遇到技术问题可添加技术微信：18570028002

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