ChIP 实验中染色质免疫共沉淀的关键要点,新手少走弯路
来源/作者:普拉特泽-生物医学整体课题外包平台
ChIP 实验中染色质免疫共沉淀的关键要点由普拉特泽生物分子实验平台为大家总结分享。普拉特泽生物为广大科研人员提供长期稳定的番红固绿染色外包实验服务,本文给大家分享咱们技术长期总结下来的ChIP实验的8个关键控制点,帮助新手少走弯路,获得可重复的高质量数据。
甲醛浓度:1%甲醛(哺乳动物细胞)vs 1.5%(植物/真菌)
交联时间:10-15分钟(过长会导致抗原表位遮蔽)
关键技巧:加入终浓度125mM甘氨酸淬灭反应
超声破碎:
目标片段大小:200-500bp(转录因子ChIP)或500-1000bp(组蛋白修饰)
必须验证:跑2%琼脂糖凝胶确认片段分布
酶解法替代方案:Micrococcal Nuclease(MNase)更适合核小体定位研究
必做对照:
Western Blot验证特异性
敲除/敲低细胞阴性对照
使用商业已验证抗体(推荐Abcam#ab1791等ChIP级抗体)
(2) 浓度优化矩阵实验
建议梯度测试:
3. 免疫沉淀:容易被忽视的细节
(1) 磁珠预处理
• Dynabeads蛋白G使用流程:
1. PBS洗涤3次
2. 用0.5%BSA封闭30分钟
3. 抗体结合时保持4℃旋转孵育(6小时最佳)
(2) 洗涤缓冲液配方升级
• 低严格度洗涤:RIPA缓冲液(150mM NaCl)
• 高严格度洗涤:RIPA+500mM NaCl(降低非特异结合)
• 去污剂选择:用0.1% Sarkosyl替代Triton X-100可减少背景
4. DNA回收:数据丢失的重灾区
(1) 解交联方案对比
(2) 柱回收vs酚氯仿
• 硅胶柱回收:保留>100bp片段(推荐Qiagen MinElute)
• 酚氯仿抽提:需额外进行糖原共沉淀(回收率提高20%)

5. 质量控制:多数实验室缺失的步骤
(1) 实时监测指标
• 片段大小:Bioanalyzer检测(比凝胶更精确)
• DNA得率:Qubit dsDNA HS检测(灵敏度比Nanodrop高100倍)
• 富集效率:阳性对照位点ΔCt应≤5(vs input)
(2) 必做功能对照
• 阳性对照:GAPDH启动子(组蛋白修饰)或已知结合位点
• 阴性对照:基因沙漠区域或使用IgG
6. 数据分析:从原始数据到发表级结果
(1) 定量方法选择树
(2) 必须报告的参数
• PCR效率:标准曲线斜率应在-3.1~-3.6之间
• 置信区间:至少3次独立生物学重复
• 统计方法:Mann-Whitney U检验(非正态数据)

7. 高阶技巧:顶级实验室的秘籍
(1) 交叉linking方案
• 双交联:先用2mM DSG处理45分钟,再用1%甲醛(适用于难结合蛋白)
(2) 微量ChIP优化
• 1000个细胞也能做:使用MAGnify™ ChIP Kit(Thermo Fisher)
(3) 自动化解决方案
• 推荐平台:IP-Star®自动化系统(减少人为误差)

8. 常见问题速查表
掌握这些核心要点,你的ChIP实验成功率将提升300%。建议收藏本指南作为实验室标准操作手册,并分享给经常抱怨"ChIP做不出来"的同事。记住:成功的ChIP=50%实验设计+30%细节控制+20%数据分析!
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