02.RNA分离
在细胞裂解后，加入氯仿进行离心。氯仿的密度大于水，且能与苯酚结合，从而抽提酸性的苯酚。苯酚的存在促使RNA进入水相，而大部分DNA和蛋白质则保留在中间相或下层有机相中。通过离心，可以实现RNA与其他细胞成分的分离。

①异硫氰酸胍属于解偶剂，是一种强力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，从而使核蛋白与核酸解聚，将RNA释放到溶液中。同时，它还能有效抑制细胞释放出的核酸酶活性，保护RNA的完整性。
②苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。苯酚虽然可以变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此常与其他成分联合使用以增强效果。
③8-羟基喹啉可以抑制RNase活性，与氯仿联合使用时可显著增强对内源性和外源性RNase的抑制作用。
④β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键，从而进一步抑制RNase活性。

1. 12孔板每孔加入700 μL的Trizol试剂（6孔板每孔加入1 mL，组织切取50 mg左右，加入1 mL的Trizol）后，于室温裂解10 min，使核酸蛋白复合物完全分离。

2. 用枪吹打细胞并将其转移至新的EP管中，每管加入140 μL的三氯甲烷（即加入Trizol体积1/5的三氯甲烷，剧烈震荡15 s，室温放置3 min）。

3. 12000 rpm，4 ℃，离心20 min，样品会分成3层：红色的有机相、中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中。

4. 小心转移上层水相（300 μL）至新的EP管中，这个过程操作要格外小心，不要吸取到有机相，可以使用黄枪头套着小枪头进行吸取，分2次吸取。加入等量体积300 μL的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min，使RNA沉淀。

5. 12000 rpm，4 ℃，离心15 min，弃上清。

6. 加入1 mL 75%乙醇，8000 rpm，4 ℃，离心5 min，重复2次洗涤能够提高RNA的纯度。

7. 离心结束后，使用吸引器将乙醇吸取干净；无吸引器的话可以将上清倒掉后，再离心1～2 min，使用黄枪头套白枪头的方法将上清弃去。

8. 室温放置晾干RNA沉淀，一般2～5 min即可，具体时间看RNA沉淀的大小，切勿干燥过度，会降低RNA的溶解度。

9. 加入适量DEPC水（无RNase水）用枪头吸打几次使RNA充分溶解。

[小编提醒] rpm在论文写作时应换算为“×g”的形式。