做细胞增殖、肿瘤药效、基因功能研究的小伙伴，一定绕不开平板克隆形成实验！
作为细胞功能实验的“黄金项目”，它既能直观反映细胞的增殖潜能、克隆存活能力、群体依赖性，也是SCI论文中最经典、认可度最高的基础实验之一。
看似只是“种细胞、养细胞、染色计数”，但很多人总会遇到细胞抱团、克隆过小、染色斑驳、数据重复性差的问题。
单个贴壁细胞在体外适宜环境中，持续分裂增殖（一般增殖6代以上），最终形成由50个以上细胞组成的细胞集落，也就是克隆。
简单来说：能形成克隆=细胞存活+具备独立增殖能力+干性稳定
通过统计克隆数量、计算克隆形成率，即可精准判断药物、基因敲除/过表达、干预处理对细胞增殖、存活能力的影响，尤其适用于肿瘤细胞增殖、放疗耐药、药物抑癌效果研究。
二、完整实验操作步骤
1. 细胞准备（关键基础）
选取对数生长期的各组细胞，弃旧培养基，PBS清洗去除残留血清与死细胞，0.25%胰蛋白酶消化，轻柔吹打制成单细胞悬液（无细胞团块是实验成功核心），完全培养基终止消化后离心重悬，充分混匀备用。
⚠️ 严禁细胞抱团！抱团细胞会导致单个克隆体积过大、计数不准，直接废掉整组数据。
2. 梯度接种（按需控密）
根据细胞增殖速度调整接种密度，常规肿瘤细胞推荐：100–700个/孔（6孔板），增殖快的细胞降低密度，增殖慢的细胞适当提高密度。
将配制好的细胞悬液均匀加入6孔板，补充足量完全培养基，轻轻十字晃动平板，避免转圈摇晃，保证细胞分散均匀，防止局部扎堆。
3. 恒温静置培养
将平板放入37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱，静置培养7–14天（部分细胞需培养至2周）。期间无需频繁观察，避免反复开合培养箱影响环境。
终止标准：肉眼可见清晰白色细胞克隆，单克隆细胞数量≥50个，无克隆融合现象即可停止培养。
4. 固定与结晶紫染色
① 弃去孔内培养基，PBS轻柔洗涤2次，彻底去除残留培养基与漂浮死细胞；
② 每孔加入适量4%多聚甲醛，室温固定30–60min，充分固定细胞形态；
③ 弃固定液，PBS清洗残留固定液，加入0.2%结晶紫染液，室温染色10–20min；
④ 缓慢流水轻柔冲洗孔板，洗去多余染液，室温倒置晾干，即可得到清晰蓝紫色细胞克隆。
5. 拍照计数与数据分析
晾干后对整孔平板拍照，可通过肉眼人工计数，或用Image J软件精准统计克隆数量、分析克隆面积。
核心计算公式
克隆形成率（%）= 实际克隆数 / 接种细胞数 × 100%
通过各组克隆形成率对比，即可直观分析实验处理对细胞增殖、存活能力的促进或抑制效果。
