【应用简介】

RNP（核糖核蛋白复合物）法 KO 稳株服务，是将预先组装好的 Cas9 蛋白与向导 RNA（gRNA）形成的 RNP 复合物，通过电穿孔技术精准导入目标细胞，实现特定基因稳定敲除（KO）的专业服务。我们依托优化的 RNP 组装体系与高效电转平台，针对客户需求设计个性化方案，构建遗传背景清晰、表型稳定的 KO 细胞株，为科研与药物研发提供核心实验模型。

【技术原理】

RNP 复合物组装：将高活性 Cas9 蛋白与靶向目标基因的特异性 gRNA 在体外进行组装，形成具有高度靶向性的编辑复合物。

电穿孔导入：利用电转仪产生的瞬时电场在细胞膜上形成微孔，使 RNP 复合物高效进入细胞，相比传统病毒转染或质粒转染，大幅提升编辑效率与细胞存活率。

精准基因敲除：进入细胞的 RNP 复合物快速识别靶基因序列并切割，触发细胞内源性 DNA 修复机制（非同源末端连接 NHEJ），最终实现目标基因的稳定敲除。

【技术优势】

低脱靶保障：RNP 复合物在细胞内半衰期短（24-48 小时），可快速降解，显著降低长期表达导致的脱靶效应，同时避免外源基因整合带来的基因组干扰

超高精准性：RNP 复合物直接作用于靶序列，无外源 DNA 整合，结合短半衰期特性。

高效转染：电转技术适配多种难转染细胞（如免疫细胞），高于脂质体转染。

快速交付：优化的 RNP 组装-电转-筛选流程，无需等待蛋白表达，稳株构建周期缩短至8-12周。

细胞友好：低电压脉冲设计减少细胞损伤，适合珍贵细胞样本。

广泛适用：覆盖肿瘤细胞、免疫细胞（如 T 细胞、NK 细胞）等 200 + 细胞类型。

【应用领域】

基因功能研究：构建特定基因 KO 稳株，通过对比野生型与 KO 细胞的转录组、代谢组差异，解析基因在细胞周期、信号通路、疾病发生中的调控机制。

肿瘤研究与药物筛选：针对肿瘤驱动基因（如 EGFR、KRAS）构建 KO 稳株，用于验证药物靶点有效性，或筛选靶向该基因的小分子药物、抗体药物。

细胞治疗研发：在 CAR-T 细胞、iPSC 等细胞治疗领域，通过 RNP 电转敲除 PD-1、TCR 等基因，增强细胞治疗效果，降低免疫排斥风险。

传染病研究：敲除病毒受体基因（如 ACE2、CD4）构建抗病毒细胞模型，用于病毒入侵机制研究及抗病毒药物筛选。

遗传病模型构建：模拟人类遗传病相关基因突变（如囊性纤维化 CFTR 基因、镰状细胞贫血 HBB 基因），建立 KO 细胞模型，助力发病机制研究与基因治疗方案开发。

【实标准化服务流程】

1. 需求定制：深入沟通客户研究目标（如基因功能、药物筛选）、靶基因信息及细胞特性（如细胞系 / 难转染程度），提供全面的可行性评估报告与个性化方案。

2. RNP 设计与组装：根据靶基因序列设计2条高特异性 gRNA。

3. 细胞电转与培养：将 RNP 复合物通过电转入细胞，置于专用培养体系中恢复培养，实时监测细胞状态。

4. 单克隆筛选与鉴定：采用流式细胞分选获得单克隆细胞，通过 PCR 扩增靶基因片段、Sanger 测序验证敲除效率，筛选纯合子克隆。

5. 交付与售后：交付合格 KO 细胞株（含冻存管2支）、完整实验报告（含 gRNA 序列、测序结果），提供 1 个月技术支持，解答后续培养与实验疑问。

【案例展示】

结肠癌细胞KO稳株构建（交付“纯”系列单克隆纯合子）

某三甲医院肿瘤研究所需构建结直肠癌细胞KO细胞株（靶基因为NPSR1），传统脂质体转染效率不足30%。我们采用RNP电转法，优化参数后转染效率达80%，8周成功交付KO单克隆纯合子，经团队后期Western blot检测，NPSR1基因敲除率100%。

【技术总结】

1. 基因型验证：采用Sanger 测序确认靶基因敲除类型（移码突变 / 片段缺失）

2. 细胞质控：

（1） 支原体检测：PCR 法检测支原体，结果阴性方可交付。

（2）追溯体系：每批次实验保留检测原始数据，支持结果溯源与重复验证。

（3）表型验证：可根据客户需求，加做细胞增殖（CCK-8）、凋亡（流式 Annexin V）、功能标志物表达（Western Blot / 流式）等表型变化检测服务。

【送检标准】

【交付标准】

1、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）