【应用简介】

BSP又称亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR），结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。

【技术原理】

使用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）都被转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应（PCR）扩增，经琼脂糖凝胶电泳，将符合预期的产物纯化回收连接T载体，进行阳性克隆测序，即可了解每个CpG位点的甲基化情况。通过统计分析，即可判断某个特定基因特定CpG岛区段内的甲基化程度。

【实验方法】

1、引物设计与测试；

2、基因组提取；

3、亚硫酸氢钠修饰DNA并纯化回收修饰产物；

4、PCR扩增、产物回收并连入T载；

5、测序分析；

6、甲基化分析与数据统计。

【案例展示】

各样本基因检测区段组间的甲基化水平差异分析

【技术总结】

       1、怎样确定基因的目标区域来进行甲基化分析呢？

转录起始位点附近的CpG岛进行DNA甲基化分析的首选区域，一般位于启动子或者5'UTR区。

2、为什么文献报导的甲基化序列不在CpG岛中？

CpG岛是甲基化密集区域，但是没有明显的CpG岛不代表就没有甲基化，甲基化也可能发生在并不密集的CG区域。

3、BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序，为什么需要构建TA克隆后测序？

PCR产物是不同样本的混合体，直接用PCR产物测序有可能在原有的C位点得到双峰图，以及由于测序前面一段序列不可靠而影响部分甲基化位点的判读，无法准确地确定甲基化的程度，因此建议进行TA克隆后测序。

【送检标准】

【交付标准】

1、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）