1. 基于结构设计
如果蛋白有晶体结构、冷冻电镜结构，或高质量的 AlphaFold 预测模型，建议优先从互作界面选择候选位点。
重点关注以下残基：
- 与配体蛋白原子距离较近的残基
- 结合前后溶剂可及表面积显著变化的残基
- 参与氢键、盐桥、疏水堆积、π-π 堆积等相互作用的残基
适合选择的位点类型：
表格
| 氨基酸类型 | 可能作用 |
|---|---|
| Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr | 形成氢键 |
| Asp、Glu、Lys、Arg | 形成盐桥或静电相互作用 |
| Leu、Ile、Phe、Trp、Val | 参与疏水作用 |
结构未知时，可结合保守基序和功能域信息进行推断。
2. 基于功能域或已知基序
如果互作依赖已知结构域或基序，例如 PDZ、SH3、卷曲螺旋、磷酸化酪氨酸基序等，可以优先在这些区域内选择位点。
设计思路包括：
- 选择结构域内进化保守的氨基酸簇
- 选择同源蛋白中已报道参与互作的保守位点
- 选择已知基序中的关键残基
这种策略特别适合蛋白结构尚未解析，但功能区域相对清楚的情况。
3. 基于翻译后修饰
很多蛋白互作不是组成型发生，而是受磷酸化、乙酰化、泛素化等修饰调控。
此时可以设计 “去修饰” 或 “模拟修饰” 突变，判断修饰是否影响互作。
常见设计方式：
表格
| 突变类型 | 设计目的 |
|---|---|
| S/T→A、Y→F | 阻断磷酸化 |
| S/T→D/E | 模拟磷酸化 |
| K→R | 阻断乙酰化或泛素化 |
| K→Q | 模拟乙酰化 |
一般来说：
- 去修饰突变可能减弱互作
- 模拟修饰突变可能增强互作
但具体结果仍需结合蛋白功能背景判断。
4. 无先验信息：截短体 + 丙氨酸扫描
如果蛋白结构和互作界面都不清楚，可以采用 “截短体缩小区域 + 丙氨酸扫描” 的策略。
丙氨酸侧链只有甲基，对蛋白骨架扰动较小，适合用于初步筛选。
推荐流程：
- 通过截短体把互作区域缩小到 10–30 aa
- 对片段内表面极性或疏水残基分批进行 Ala 替换
- 检测突变体与互作蛋白的结合变化
- 初筛阳性位点后再进行精细验证
如果原位点本身是 Ala，也可考虑替换为：
- Gly：增加柔性
- Ser：保留弱极性
