无需制胶、无需电泳、无需转膜，直接点膜孵育，半天搞定批量样本核酸/蛋白定性+半定量。
实验原理
Dot Blot 将处理好的样品（蛋白、DNA 或 RNA）直接定量点加在固相支持膜（PVDF 膜或硝酸纤维素 NC 膜）上，通过物理吸附或化学交联使目标分子固定在膜上。随后利用特异性抗体（蛋白检测）或标记探针（核酸检测）与目标分子结合，再通过酶标二抗或探针标记物进行信号放大，最后通过化学发光、显色或荧光成像实现定性或半定量检测。该方法操作简便、耗时短、通量高，常用于蛋白快速筛查、修饰检测（如 m6A、磷酸化、乙酰化等）、抗体效价验证及样本批量初筛。
实验操作步骤（以蛋白检测为例）
样本制备：细胞/组织样本加入预冷 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解 30min，4℃ 12000r/min 离心 15min，取上清，BCA 法定量后与 5×SDS 上样缓冲液 4:1 混合，100℃ 变性 5-10min，室温冷却备用。
膜预处理：裁剪 PVDF 膜，左上角剪小角标记方向，用铅笔轻画网格（1cm×1cm）用于定位。PVDF 膜需无水甲醇活化 30-60s，NC 膜无需活化。活化后 TBST 平衡 5min。
点样：膜平铺于干净滤纸上，吸干表面液体至半干状态。用微量移液器吸取 1-2μL 样品，垂直滴加于网格中央，枪头勿触碰膜面。每样设 3-6 个梯度浓度（如 400ng、200ng、100ng），同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。点样后室温晾干 20-30min，或 37℃ 烘干 20min。
封闭：膜放入封闭盒，加入 5% 脱脂奶粉或 BSA 封闭液（磷酸化抗体建议用 BSA），室温摇床封闭 1h 或 4℃ 过夜。
一抗孵育：弃封闭液，加入 TBST 稀释的一抗工作液，确保液体完全覆盖膜面。4℃ 摇床孵育过夜或室温 1-2h。
洗膜：回收一抗（可重复使用 2-3 次），TBST 洗涤 3 次，每次 5min，充分去除未结合一抗。
二抗孵育：加入 TBST 稀释的 HRP 标记二抗（常规稀释比 1:5000-1:10000），室温摇床孵育 1h。
洗膜：TBST 洗涤 4 次，每次 5min，最后一次洗涤可延长至 10min 降低背景。
显影成像：膜上均匀滴加 ECL 化学发光液，室温孵育 2min，用化学发光成像仪曝光。曝光时间根据信号强度调整（明亮条带 1min，隐约可见 2min，不可见 5min）。
关键注意事项
点样控制：点样量宁少勿多，过多易扩散导致斑点弥散；每次加样更换枪头，避免交叉污染；点样后必须彻底晾干，否则样品会扩散。
封闭与洗涤：封闭务必充分，洗涤需彻底，否则容易产生黑点或高背景；磷酸化抗体检测建议用 BSA 封闭，避免脱脂奶粉中的磷酸蛋白干扰。
对照设置：必须设置阳性对照（已知含目的蛋白样本）、阴性对照（空白裂解液）和空白对照（缓冲液），用于判定实验有效性。
膜的选择：蛋白检测常用 PVDF 膜（结合能力强）或 NC 膜；RNA 检测建议用尼龙膜，避免 NC 膜出现空心圆现象。
核酸检测差异：DNA/RNA 点样前需变性（95℃ 加热 3min 或甲醛变性），点样后需紫外交联 30-40min 或 80℃ 烘烤 2h 固定；杂交液含 SSC 缓冲液，洗膜用 2×SSC/0.1% SDS 和 0.1×SSC/0.1% SDS 梯度洗涤。
