通常情况下，一些看家基因的表达很稳定，是做内参的首选。比如β-actin、GAPDH，基本上细胞有多少，它也相应有多少，所以可以看作是样本总量的一个参照物，所以内参也叫loading control。
但，并不意味任何课题都可以闭眼用这两货做内参。常用的内参可见下图汇总：
选择内参的依据，我认为可以归纳为以下几点： • 内参蛋白表达是否稳定 • 目标蛋白的亚细胞定位 • 内参和目标蛋白大小差异
先说第一个，内参蛋白表达是否稳定。 内参蛋白之所以表达稳定，是因为不受大多数生理活动调节的影响。但凡是有例外。 比如β-actin，绝大多数情况很稳定。但如果研究细胞骨架本身，比如加药刺激诱导细胞骨架重排，那这个时候β-actin表达就可能会有波动了。 此外，内参蛋白在不同组织中的表达也会存在差异，以下图CST官网的这份测试结果来看，不同部位的小鼠组织，对应的内参蛋白表达量也不尽相同。 如果你研究的课题，要同时对小鼠取心脏、脑、肾几个组织来跑wb，用β-actin可能就不太合适了，因为它在心脏中的表达比较低。
所以，大家会发现，内参蛋白表达是否稳定这一点，是相对而言的。并不存在任何情况下都适用的内参，要根据你研究什么来挑。这里就不得不说蛋白提取的方法，我们常用的是使用RIPA裂解液配合蛋白酶抑制剂完成蛋白提取。RIPA裂解整个细胞的效率是不一致的，因为它是一个广谱的玩意，有时候胞浆已经完全搞定了，但核却还未完全裂解好。如果咱们研究的目标蛋白在细胞核内，并且，与染色体紧密结合，那再用GAPDH做内参就不行了。因为GAPDH存在于胞浆，即使核完全未裂解，GAPDH信号也可以正常；但核蛋白就可能丢失。所以，为了避免这种情况的出现，我的建议是选择稳定在核内表达的蛋白做内参，比如Histone H3,它是染色体的核心组蛋白，严格定位于细胞核。在各种处理、分化状态下，组蛋白总量相对稳定（因为DNA的含量是恒定的）反过来，如果在western blot时，发现内参Histone H3表达特别低的话，还可以倒推去分析是不是这个样本提取时出了啥问题？咱们做western blot，最后要分析数据，就需要有目标蛋白和内参蛋白的条带。不管你是整张膜孵育抗体，还是裁膜孵育，目标蛋白至少要和内参有一定的分子量差别，否则它们俩黏得特别近，就无法裁剪开，软件分析时也会无法区分。所以，我们需要让目标蛋白分子量要与内参蛋白尽量错开，实在没条件，也要争取两者至少相差5-10kDa。内参，就是western blot实验的样本内部对照，用来校准样本因上样量差异造成的结果偏差。而与此同时，在western blot实验设计的同时，还需要考虑实验本身的对照。它们不是为了校准样本差异，而是在实验结束后，用来确认实验结果是否可靠、以及排查问题时使用的。阳性对照的目的是证明你的实验操作和实验系统（试剂/耗材/设备）没问题。它通常单独占用凝胶的一孔，已知高表达目标蛋白的样本（比如，重组蛋白、过表达的细胞裂解液、已知高表达的组织/细胞系的蛋白样本）。是不是每次都要用呢？我个人觉得不是必须。在你换了新的抗体、上了新的实验系统后，要验证操作或抗体时使用。如果阳性对照有条带，而样本没有，说明操作没问题，问题出自样本中的蛋白确实表达低或不表达。如果阳性对照都没有条带，就可以推测抗体不合适、不行，或实验步骤出错。阴性对照的目的是证明条带信号是“特异性的”，而非背景或非特异结合。通常也是单独占用一孔，使用不表达该蛋白的细胞系提取的蛋白样本，或敲除了的细胞系样本。没有上述条件的情况下，可以选择把这一孔的位置剪下来，不加一抗，只加二抗，看看是否有条带和背景是否高。
以上图为例，LPS刺激RAW细胞，并检测不同刺激时间后的Saa3蛋白表达变化，从左到右1-4是样本组，用于分析刺激时间和表达量的关系。第5列是阴性对照，不加LPS刺激的细胞进行检测，验证是LPS刺激才产生Saa3的表达，不加则没有。同时单独设置阳性对照，用过表达Saa3的HEK293T细胞做阳性对照，来验证实验系统没问题。最后，是空白对照。它的目的是为了检查你的试剂是否有污染。
通常也是选一个孔，用等体积的RIPA代替样本，其他的步骤一切照常，它可以和正常的孔一起操作到最后显影。如果有条带，证明试剂可能存在蛋白污染了。
好，本期就到这。后续这个系列还有2篇，分别会围绕以下主题来分享，感兴趣的小伙伴可以留意～可以随时关注我们普拉特泽生物哦：18570028002（微信同号）
文源自：实验老司机
