【应用简介】

DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

【技术原理】

蛋甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）

Herman 等（ 1996 ）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 

特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生甲基化。

亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）

亚硫酸氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA 甲基化方法，此方法可靠性及精确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。

特点：精确度高，能够准确检测出甲基化的程度百分比。

【实验方法】

1、 引物设计；

2、 DNA提取；

3、 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA；

4、 修饰后DNA纯化回收；

5、修饰后DNA用于PCR；

6、 PCR产物的凝胶电泳检测扩增条带；

7、完成。

【案例展示】

【技术总结】

1、怎样确定基因的目标区域来进行甲基化分析呢？

转录起始位点附近的CpG岛进行DNA甲基化分析的首选区域，一般位于启动子或者5‘UTR区。

2、为什么文献报导的甲基化序列不在CpG岛中？

没有明显的CpG岛不代表就没有甲基化，甲基化也可能发生在并不密集的CG区域。

3、BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序，为什么需要构建TA克隆后测序？

如果进行PCR产物测序就有可能在原有的C位点得到双峰图，无法确定甲基化的程度。

【送检标准】

【交付标准】

1、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）