【应用简介】

SNP 检测主要针对基因组上单核苷酸位点变异进行分型分析，广泛应用于疾病易感风险评估、肿瘤分子分型、药物基因组学、遗传多态性分析、物种亲缘鉴定等领域。可精准解析基因位点差异，为疾病筛查、个体化用药指导及基础遗传学研究提供分子依据。

【技术原理】

taqman探针法：针对染色体上的不同SNP位点分别设计PCR引物和TaqMan探针，进行实时荧光PCR扩增。探针的5’-端和3’-端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当溶液中存在PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’-端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET，发出荧光。通常用于少量SNP位点分析。

高分辨率熔解曲线分析（HRM）是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

 图：某基因的SNP（G>A）进行HRM分析的结果。左图为熔解曲线，右图为差异图

SNaPshot法：是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。

直接测序法：在所有SNP的检测方法中，对待检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法，也是SNP分析的金标准。纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。该技术主要通过直接测序的方法来确定位点的基因型，这种分型方法准确性最高，但费用大。如果需要检测的几个SNP位点正好位于一个测序单元内（长度小于700 bp），则单个位点的分型费用可显著降低，这种分型技术不失为一种良好选择。对于准确性要求特别高或样本量特别小（几个或几十个）的项目，这种分型技术很适合。

【实验方法】

1、变性阶段

高温条件下，双链模板 DNA 发生热变性解链，解离为单链 DNA 模板；体系内上游 / 下游引物、两端分别标记荧光发光基团（Fluorophore，F）与荧光淬灭基团（Quencher，Q）的特异性 TaqMan 探针均处于游离单链状态。

2、退火结合阶段

体系温度降低，引物与单链模板 DNA 的互补序列特异性结合；同时TaqMan 特异性探针精准杂交结合至模板 DNA 引物之间的目的靶序列区域。

此时 DNA 聚合酶（Taq 酶）结合至引物结合位点，沿模板链启动 DNA 链延伸过程；探针依旧保持完整结构，荧光淬灭效应仍存在，体系依旧无有效荧光信号释放。

3、延伸酶切阶段

DNA 聚合酶沿模板链进行 5’→3’方向链延伸合成；当聚合酶行进至探针结合位置时，依靠自身5’→3'核酸外切酶活性，将结合在模板上的探针从 5’端开始逐步酶切降解。探针被切割后，荧光发光基团（F）与淬灭基团（Q）发生空间分离，二者间的荧光共振能量转移（FRET）效应消失，发光基团的荧光抑制解除，释放可被仪器检测的特异性荧光信号。DNA 链持续延伸，探针不断被酶切降解，随着循环数增加，荧光信号持续累积增强。

【送检标准】

【交付标准】

1、实验报告

2、真实实验结果

3、原始图片

4、实验原始数据

5、剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）