原代细胞培养是疾病研究、药物筛选的黄金模型，但高达80%的研究者因污染或细胞凋亡被迫重复实验，普拉特泽生物细胞实验平台专业承接细胞衰老实验外包、细胞诱导等细胞实验代做服务，积累专业丰富的实验操作经验揭秘从分离到传代的全流程避坑技巧，助您一次获得高活性细胞。

一、分离阶段：高活性细胞获取的5大关键

1. 组织解离方案优化

防凋亡技巧：

▲解离全程使用预冷无钙镁PBS，减少膜损伤

▲添加ROCK抑制剂Y-27632（10μM），阻断失巢凋亡

2. 纯化：彻底去除“细胞杀手”

红细胞污染→ 红细胞裂解液（ACK Buffer）处理2分钟

成纤维细胞污染→ 差速贴壁法：接种30分钟后移除非贴壁细胞

死细胞碎片→ 密度梯度离心（Percoll 1.075 g/mL）

二、培养阶段：零污染+高存活率实战方案

1. 培养基配方黄金组合

关键提示：胎牛血清（FBS）需热灭活（56℃ 30分钟）并过滤除菌

2. 操作防污染六步法

●手套处理：接触培养瓶前酒精喷洒，每30分钟更换

●试剂分装：培养基、酶解液按单次用量分装冻存

●超净台管理：实验前UV灭菌30分钟，台面预留“无菌核心区”

●瓶口火焰消毒：移液前灼烧瓶口3秒

●液体移取：专用移液管禁止交叉使用

●环境监控：每周沉降菌检测（血平板暴露30分钟）

三、防凋亡：延长细胞寿命的三大策略

1. 传代操作规范

消化终止时机：显微镜下80%细胞回缩变圆（非脱落）

中和操作：含血清培养基中和胰酶（禁用PBS直接冲洗）

轻柔吹打：宽口吸头沿壁吹打≤5次（保持细胞团块适度）

2. 抗凋亡添加剂

3. 冻存复苏要点

冻存液配方：90% FBS + 10% DMSO（逐步降温：4℃→-20℃→-80℃→液氮）

快速复苏：37℃水浴≤90秒，离心去除DMSO后立即换液

四、污染与凋亡应急处理方案

1. 污染识别与挽救

2. 凋亡细胞挽救

早期凋亡（Annexin V+ PI-）：添加Z-VAD-FMK（20μM）并补生长因子

晚期凋亡（Annexin V+ PI+）：弃用该批次细胞，优化传代密度

五、实战案例：从失败到成功的蜕变

背景：某实验室人肝原代细胞培养3次失败（污染率100%，72小时凋亡率>80%）

优化方案：

解离液添加DNA酶Ⅰ + Y-27632

培养基改用William's E + 双抗 + 两性霉素B

操作台增加挡板，严格火焰消毒

结果：

污染率降至0%，72小时存活率>95%

成功传至P5代，白蛋白分泌量维持稳定

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