Question：原代细胞鉴定不准怎么办？（普拉特泽生物提供长期稳定的细胞实验外包服务）

   答：原代细胞鉴定对于科研的准确性和可靠性至关重要，免疫荧光和流式细胞术是常用的鉴定方法，但在实际操作中，常常会出现鉴定不准的情况。下面将为你详细介绍优化这两种方案的指南，帮助你获得更精准的原代细胞鉴定结果。

1.细胞培养状态：确保原代细胞处于良好的生长状态，细胞密度适中。对于贴壁细胞，在细胞融合度达到 50% - 80% 时进行实验最佳，此时细胞既保持了良好的活性，又未因过度生长而影响形态和抗原表达。例如，培养的原代肝细胞，当呈现典型的多边形、铺路石样排列，且融合度在合适范围时，进行免疫荧光实验能更好地显示其特征。

2.固定与透化：选择合适的固定剂是关键。甲醛（多聚甲醛形式常用）是常用的固定剂，能有效中止细胞降解和原位固定蛋白，但浓度需严格控制，一般为 1% - 4%，孵育 10 - 20 分钟，以确保既能稳定细胞结构，又不会过度交联阻碍抗体与抗原的结合。对于一些与膜相关的靶标抗原，需保持脂质完整性，此时应避免使用乙醇、丙酮等有机固定剂，因其会溶解脂质。

3.抗原修复：某些抗原表位可能因细胞固定或在细胞内形成复合物而被掩蔽。抗原修复技术可提高抗体与靶标抗原的接触机会，但用于载玻片细胞时需谨慎并预先测试。例如，热修复方法可能对原代细胞造成损伤，导致细胞形态改变甚至脱落，因此要根据细胞类型和抗原特性选择合适的修复方法和条件。

①特异性抗体筛选：选择高特异性的一抗是免疫荧光实验成功的核心。首先要确保抗体针对的是目标细胞的特异性抗原，可参考相关文献、抗体供应商提供的应用数据，了解该抗体在类似原代细胞鉴定中的使用情况。例如，鉴定原代神经元细胞时，针对神经元特异性标志物（如 NeuN）的抗体，需选择经过验证在神经元原代细胞中能准确识别且背景信号低的产品。

②抗体浓度优化：不同来源和批次的抗体，其最佳工作浓度可能有所差异。通过设置一系列抗体浓度梯度进行预实验，如从 1:100、1:200、1:400 等比例开始，观察荧光信号强度和背景情况，确定能产生清晰特异性信号且背景最低的抗体浓度。过高的抗体浓度可能导致非特异性结合增加，背景信号增强；过低则可能信号微弱，难以准确判断。

③二抗的匹配：二抗需与一抗来源种属相匹配，且应选择荧光标记清晰、信号稳定的产品。同时，要注意二抗的浓度也需进行优化，方法与一抗类似。例如，若一抗为兔源抗体，二抗则应选择抗兔 IgG 的荧光标记抗体，如 Alexa Fluor 系列的山羊抗兔 IgG 二抗，其具有良好的荧光特性和稳定性。

1. 封闭处理：在加入一抗前，使用 5% 的正常血清（来源于二抗生产种属）溶液或等浓度的牛血清白蛋白（BSA）进行封闭，可有效减少二抗的非特异性结合。封闭时间一般为 30 - 60 分钟，确保封闭液充分覆盖细胞样本。某些实验室会联合使用血清和 BSA，以增强封闭效果。

2. 染色过程控制：整个染色过程需在避光条件下进行，以防止荧光染料发生光漂白。孵育一抗和二抗时，要确保孵育温度和时间适宜，一般一抗孵育在 4℃过夜或室温孵育 1 - 2 小时，二抗孵育在室温下 30 - 60 分钟。同时，在每次抗体孵育后，需用适当的缓冲液充分洗涤细胞，去除未结合的抗体，减少背景干扰。

3. 成像参数优化：使用荧光显微镜成像时，需根据荧光染料的特性调整激发光波长和发射光滤光片。例如，常用的 FITC 荧光染料，其最大发射荧光波长为 525nm 左右，需选择与之匹配的激发光和滤光片组合。此外，要调整显微镜的曝光时间、增益等参数，避免信号过强或过弱，以获得清晰、对比度良好的荧光图像。可通过拍摄不同参数下的图像进行比较，确定最佳成像设置。

1. 细胞活性与纯度：原代细胞在进行流式检测前，需确保细胞活性良好，可通过台盼蓝染色等方法检测细胞活力，活力应在 90% 以上。同时，要尽量去除细胞悬液中的杂质、细胞碎片等，可通过低速离心（如 300 - 500g，5 - 10 分钟），弃去上清中的杂质，再用合适的缓冲液重悬细胞。例如，从组织中分离得到的原代免疫细胞，在流式检测前需充分洗涤，去除组织碎片和死细胞，以保证检测结果的准确性。

2. 细胞计数与浓度调整：准确计数细胞数量，并将细胞浓度调整至合适范围，一般为 1×10^6 - 1×10^7 个 /mL。细胞浓度过高可能导致细胞聚集，影响检测结果；过低则信号强度不足。可使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

1. 荧光抗体选择：选择与流式细胞仪检测通道匹配的荧光抗体，确保荧光信号能被准确检测。同时，要考虑荧光抗体的稳定性、特异性和荧光强度。例如，在检测多种细胞表面标志物时，需选择不同荧光颜色且光谱重叠小的抗体，如 FITC、PE、APC 等，以避免信号干扰。

2. 抗体标记条件优化：确定合适的抗体标记时间和温度。一般在 4℃孵育 30 - 60 分钟，既能保证抗体与细胞表面抗原充分结合，又能减少非特异性结合。标记过程中要轻轻混匀细胞与抗体，避免细胞受损。此外，需设置同型对照，即使用与一抗相同种属、亚型且不针对目标抗原的抗体进行标记，用于扣除非特异性荧光信号。

3. 补偿调节：由于不同荧光染料的发射光谱存在一定重叠，在多色荧光检测时需进行补偿调节。通过使用单染样本，即只标记一种荧光抗体的细胞样本，在流式细胞仪上检测并设置补偿参数，使不同荧光通道之间的信号干扰最小化，确保每个通道检测到的荧光信号准确反映目标抗原的表达情况。

1. 仪器参数设置：根据细胞类型和荧光抗体的特性，调整流式细胞仪的电压、增益等参数，使细胞信号分布在合适的检测范围内，避免信号溢出或过低。例如，对于弱表达的抗原，可能需要适当提高检测通道的电压以增强信号强度。

2. 数据采集与分析：采集足够数量的细胞数据，一般建议采集 1×10^4 - 1×10^5 个细胞，以保证结果的统计学意义。使用专业的流式数据分析软件，如 FlowJo 等，对采集到的数据进行分析。首先通过设门排除细胞碎片、粘连细胞等杂质，然后分析目标细胞群中荧光信号的强度和分布，以确定细胞表面抗原的表达水平。可通过绘制直方图或散点图等方式直观展示数据分析结果。