原代细胞培养由普拉特泽生物为大家总结分享，普拉特泽生物细胞实验平台专业承接细胞诱导/分化外包、血管生成等细胞实验代做服务，积累专业丰富的实验操作经验。

原代细胞培养是肿瘤研究、药物筛选及再生医学的基石，但高达70%的初学者因污染、老化或表型丢失导致实验失败。本次整合《Nature Protocols》最新标准及顶级实验室经验，提炼分离→扩增→鉴定全流程黄金法则，助你轻松跨越技术鸿沟！

一、原代细胞分离：高活性细胞的获取关键

1. 组织解离方案优化

避坑指南：

避免过度消化（损伤细胞膜）→ 预实验确定最佳时间

添加DNA酶Ⅰ（10 U/mL）防止DNA粘稠物包裹细胞

2. 细胞纯化技术选择

▲免疫磁珠分选（MACS）：

阳性筛选：CD31+微珠分选血管内皮细胞（纯度>95%）

阴性筛选：去除成纤维细胞（抗Fibroblast微珠）

▲流式分选（FACS）：

适用稀有细胞（如肿瘤干细胞），需抗体标记（如CD133）

二、原代细胞扩增：突破增殖瓶颈的实战策略

1. 培养基配方黄金组合

关键技巧：

血清批次验证：新批次血清与原批次平行培养，增殖率差异应<10%

预防老化：传代时保留条件培养基（30%）维持分泌因子平衡

2. 传代操作规范

消化终止时机：显微镜下80%细胞回缩变圆（而非脱落）

轻柔吹打：使用宽口吸头，沿培养瓶壁缓慢吹打≤5次

接种密度：

贴壁细胞：1×10⁴ cells/cm²

悬浮细胞：2×10⁵ cells/mL

三、细胞鉴定：三重验证确保表型真实性

1. 形态学鉴定

关键技巧：

●血清批次验证：新批次血清与原批次平行培养，增殖率差异应<10%

●预防老化：传代时保留条件培养基（30%）维持分泌因子平衡

2. 传代操作规范

●消化终止时机：显微镜下80%细胞回缩变圆（而非脱落）

●轻柔吹打：使用宽口吸头，沿培养瓶壁缓慢吹打≤5次

接种密度：

贴壁细胞：1×10⁴ cells/cm²

悬浮细胞：2×10⁵ cells/mL

四、细胞鉴定：三重验证确保表型真实性

2. 标志物检测方案

免疫荧光/组化：

上皮细胞：CK18+/Vimentin-

间充质干细胞：CD73+/CD90+/CD105+

神经元：β-tubulin Ⅲ+/GFAP-

流式细胞术：

分析≥3个标志物，设同型对照排除假阳性

3. 功能验证

分化潜能：

▲脂肪细胞：油红O染色（诱导14天）

成骨细胞：茜素红染色（诱导21天）

代谢活性：

肝细胞：CYP450酶活性检测

心肌细胞：搏动频率记录（>60次/分钟）

五、5大常见失败场景与挽救方案

如果想知道更多的关于原代细胞培养终极入门的相关资料和知识点，以及专属研究方法，也可以联系我们：18570028002 或 微信 pulateze666会把这些资料发送给大家哦。