原代细胞分离培养实验注意事项由普拉特泽生物为大家总结分享，普拉特泽生物细胞实验平台专业承接血管生成实验外包、细胞衰老等细胞实验代做服务，积累专业丰富的实验操作经验。上期我们分享原代细胞高效分离培养技巧后大家都说不够详细，有一些注意事项没有写出来，那今天咱们就为大家专门出一期原代细胞分离培养实验注意事项，快点学起来吧！普拉特泽生物可将系统解析从分离到传代的全流程核心技巧，助大家一次获得高活性细胞

分离阶段——高活性细胞获取的关键步骤

组织解离方案优化

▲全程预冷处理：解离全程使用4℃无钙镁PBS缓冲液，减少细胞膜损伤

▲抗凋亡添加剂：添加10μM ROCK抑制剂Y-27632，阻断失巢凋亡通路

▲酶解优化：联合使用DNA酶Ⅰ（0.1 mg/mL）和胶原酶Ⅳ，减少DNA粘连导致的团块形成

纯化：彻底清除“细胞杀手”

●红细胞污染：用ACK裂解液处理2分钟，立即离心终止

●成纤维细胞污染：差速贴壁法处理——接种30分钟后移除非贴壁细胞

●死细胞碎片：Percoll密度梯度离心（1.075 g/mL），去除上清碎片

组织块培养法特殊技巧

→前3天静置培养：避免移动或振动培养瓶，防止组织块脱落

→控制培养液量：液面刚好覆盖组织块，减少流体波动导致的脱落

→促贴壁处理：种植前在瓶底涂布胶原薄层（5 μg/cm²），加速贴附

→关键提示：原代细胞分离后首次接种密度应提高至标准密度的1.5倍。高密度培养模拟体内细胞间相互作用，显著提高存活率。待细胞适应环境后传代时再降低密度。

培养阶段——零污染与高存活率的实战方案

〖培养基优化组合〗

基础培养基选择：上皮细胞用DMEM/F12，肝细胞用William's E，神经元用Neurobasal

血清处理：胎牛血清（FBS）需56℃水浴30分钟热灭活，0.22μm滤膜过滤除菌

添加剂配方：1%双抗（青霉素-链霉素） + 0.5μg/mL两性霉素B + 10ng/mL表皮生长因子

〖贴壁细胞培养要点〗

●贴壁窗口期：接种后立即放入培养箱3-5小时，待细胞贴壁再补足培养液

●吹打技巧：宽口吸头沿瓶壁轻柔吹打≤5次，保留适度细胞团块（直径3-5个细胞）

●换液时机：培养液呈橙黄色时最佳，淡黄色提示营养枯竭

〖悬浮细胞特殊管理〗

□悬浮维持：添加0.01%透明质酸复合物增加粘度

□搅拌培养：液量≥5mL，转速控制在30-50rpm避免气泡损伤

□换液策略：采用低速离心（200g × 5min）或半量换液法，避免细胞丢失

污染防控六步法

手套处理：接触培养瓶前喷洒75%乙醇，每30分钟更换

试剂分装：培养基、酶解液按单次用量分装，-80℃冻存

超净台管理：

●UV灭菌30分钟

台面预留20×20cm“无菌核心区”

→瓶口消毒：移液前酒精灯外焰灼烧瓶口3秒

→移液规范：专用移液管禁止交叉使用，液体避免接触管壁

→环境监控：每周沉降菌检测（血平板暴露30分钟）

防凋亡——延长细胞寿命的三大策略

精准传代操作

▲消化终止时机：显微镜下观察，80%细胞回缩变圆（而非完全脱落）时立即终止

▲胰酶中和：含10%FBS的培养基中和（禁用PBS直接冲洗）

▲传代密度控制：首次传代保持较高密度（70-80%汇合度），后续降至50%

抗凋亡添加剂应用

▲早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻）：添加20μM Z-VAD-FMK（半胱天冬酶抑制剂）

▲应激性凋亡：补充5ng/mL HGF或IGF-1生长因子

冻存复苏标准化流程

□冻存液配方：90%FBS + 10%DMSO，逐步降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）

□快速复苏：37℃水浴≤90秒，离心去除DMSO后立即换新鲜培养基

□复苏后处理：6-16小时内更换培养基，清除死细胞

实战案例——从100%污染到零污染的蜕变

背景：某实验室人肝原代细胞连续3次培养失败（污染率100%，72小时凋亡率>80%

优化方案：

●解离阶段：添加DNA酶Ⅰ + 10μM Y-27632

●培养基：改用William's E + 双抗 + 两性霉素B（2.5μg/mL）

●操作台：增加侧挡板，严格火焰消毒瓶口

●环境控制：每周沉降菌检测，湿度<60%

结果：

污染率降至0%

72小时存活率>95%

成功传至P5代，白蛋白分泌量维持稳定

常见问题解答

Q：原代细胞与细胞系有何本质区别？

A：原代细胞直接从组织分离，生命周期有限且保持原始特性；细胞系经遗传改造永生化，长期传代易致基因漂变。

Q：消化时细胞成团脱落如何处理？

A：加入0.002% DNase I 处理5分钟，同时用宽口吸头轻柔吹打。

Q：复苏后细胞贴壁不良怎么办？

A：优先采用胶原包被培养瓶（5μg/cm²），接种后预培养4小时再补液

Q：如何判断最佳传代时机？

A：贴壁细胞达80%汇合度时传代，首次传代不建议低于此阈值
    如果想知道更多的关于原代细胞分离培养的相关实验案例和知识点，以及专属研究方法，也可以联系我们：18570028002 或 微信 pulateze666会把这些资料发送给大家哦，还要我们的实验交流群可学习探讨