点击化学EdU检测法由普拉特泽生物细胞实验平台为大家总结分享。普拉特泽生物为广大科研人员提供长期稳定的EdU检测外包实验服务，本文给大家分享咱们技术长期总结下来的免抗体标记，1小时解锁细胞增殖精准图谱。

无需抗体、无需DNA变性、无需过夜孵育——一次点击化学反应，让增殖细胞无处遁形。

在细胞增殖研究的历程中，科学家们长期面临一个技术困境：如何在精准标记DNA复制活跃细胞的同时，最大程度保留细胞原始状态？传统BrdU检测法虽广泛应用，但其依赖的抗体识别机制和DNA变性步骤如同一把双刃剑——在暴露抗原表位的同时，也破坏了细胞的精细结构和生物分子网络。而EdU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）检测法的诞生，凭借点击化学（Click Chemistry） 这一诺奖技术，彻底重塑了细胞增殖检测的范式。

1 技术原理解析：
——点击化学如何实现免抗体检测

EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，其分子结构的精妙之处在于：C5位的甲基被乙炔基取代。这一微小却关键的改造，赋予了它革命性的检测优势。

DNA掺入机制。

当细胞进入DNA合成期（S期），EdU通过核苷转运蛋白进入细胞核，替代天然胸苷掺入新合成的DNA链中，其掺入效率与胸苷相当，不影响细胞周期进程。

点击化学反应核心

检测过程无需抗体介入，而是通过铜离子（Cu⁺）催化的炔-叠氮环加成反应实现：EdU的乙炔基与荧光标记的叠氮化物（如Alexa Fluor 488叠氮）在30分钟内形成稳定的三唑环，直接共价连接荧光信号。

化学方程式：

EdU-乙炔基 + 叠氮-荧光染料 → 荧光标记DNA

2.分子尺寸的革命性突破

荧光叠氮化物的分子量仅为BrdU抗体的1/500（~500 Da vs 150 kDa），这一特性彻底解决了大分子抗体难以渗透组织深层的问题，为类器官、组织切片等复杂样本的均一标记扫清了障碍。

核心优势：为何EdU成为高效检测的新标杆

 速度跃升：从小时级到分钟级

传统BrdU法需经历DNA变性（酸/热解）、一抗/二抗孵育（≥90分钟）、多次洗涤等冗长步骤，总耗时5小时至过夜17。而EdU检测仅需三步核心操作：

EdU孵育（2-24小时，与细胞周期同步）

固定透化（15分钟）

点击反应（30分钟）

总耗时压缩至1-2.5小时，效率提升70%以上

样本完整性：告别DNA变性损伤

BrdU法必需的DNA变性步骤（如4M HCl处理或高温）导致三大硬伤：

□细胞核皱缩：酸解破坏染色质结构，共聚焦成像模糊

□抗原表位损毁：难以与Ki-67、磷酸化组蛋白等胞内蛋白标记联用

□组织解离风险：尤其对冰冻切片或脑组织样本，变性后易碎片化

□EdU法仅需温和的固定透化处理（4%多聚甲醛 + 0.5% Triton X-100）：

细胞三维形态

膜蛋白抗原表位（如CD分子）

DNA高级结构（如核小体排列）

灵敏度跃升：单细胞水平的精准捕捉

得益于小分子染料的高效扩散与直接化学结合，EdU信号强度达BrdU的3-5倍，尤其擅长检测：

→低增殖活性细胞：如干细胞静息群体、神经元前体细胞

→微量增殖信号：药物处理后的残余癌细胞、免疫治疗后的T细胞克隆扩增

在乳腺癌类器官模型中，EdU+Ki-67双标揭示的癌细胞抑制率较BrdU提升40%，为药物疗效评估提供了更可靠依据。

 标准化操作指南：1小时极速检测方案（以贴壁细胞为例）

试剂准备

→EdU工作液：10 μM（快速增殖细胞）至50 μM（慢周期细胞），溶于完全培养基

→点击反应混合液：含荧光叠氮化物（如Alexa Fluor 488）、CuSO₄、抗坏血酸钠（还原剂）

四步操作流程

EdU脉冲标记

将预热EdU工作液加入细胞培养基（终浓度10 μM）

孵育2小时（高增殖细胞）至24小时（全周期覆盖）

固定与透化

4%多聚甲醛固定15分钟（室温）

关键提示：避免醇类固定剂，防止DNA结构改变

0.5% Triton X-100透化20分钟（超过0.5%或延长至30分钟将导致信号弥散）

点击化学反应

加入含荧光叠氮化物的反应液，避光孵育30分钟

铜毒规避：添加Click添加剂（如BeyoClick™试剂盒中的螯合剂）保护敏感细胞

复染与成像

DAPI染核（5分钟）

荧光显微镜或流式细胞仪检测

适用样本扩展：

石蜡切片需延长透化至40分钟；活体注射剂量为5 mg/kg（小鼠模型）

多场景应用突破：从基础科研到临床前研究

复杂模型中的精准解析

3D类器官与组织切片：小分子染料渗透至类器官深层，在冰冻/石蜡切片中实现均一标记

活体动态追踪：腹腔注射EdU标记小鼠，结合透明化技术（如CLARITY）构建全器官增殖图谱

 多组学关联研究

免疫表型关联：流式中EdU与CD4/CD8/PD-1抗体兼容，同步解析T细胞增殖与活化状态

细胞周期同步分析：配合DAPI核染色，计算S期细胞比例及G1/S/G2-M期分布

荧光蛋白共定位：适用于转基因荧光蛋白细胞系，活体追踪增殖干细胞迁移

转化医学应用实例

 常见问题破解：实验优化关键点

Q1：点击反应出现高背景噪音？

铜离子浓度与抗氧化控制：优化Cu²⁺至0.1-1 mM，添加抗坏血酸钠（100 mM）淬灭自由基。使用Click-iT Plus试剂盒可兼容R-PE等易淬灭染料。

Q2：组织切片透化不足导致信号弱？

梯度透化法：先以0.1% Triton X-100处理10分钟，检测信号强度；若不足则升至0.3%，避免超过0.5%导致组织解离。

Q3：能否与BrdU联用进行双时间点追踪？

MoBU-1抗体的特异性应用：

先脉冲EdU（20 μM × 1小时）

再脉冲BrdU（10 μM × 1小时）

点击化学标记EdU后，用克隆MoBU-1抗体（无EdU交叉反应）检测BrdU。

Q4：EdU长期孵育是否影响细胞周期？

浓度窗控制：常规浓度（≤10 μM）孵育24小时内无显著影响。但>50 μM或>48小时可能激活DNA损伤反应（γH2AX通路），建议设置浓度梯度验证。

未来演进：当点击化学遇见多组学整合

EdU技术正从“替代BrdU的工具”升级为细胞动力学研究的核心引擎，其边界持续拓展：

○近红外活体成像：Alexa Fluor 790叠氮化物（Ex/Em：785/814 nm）穿透深度提升至3 mm，实现肿瘤增殖原位监测

○多核苷酸联用探针：如F-ara-EdU同步实现增殖标记与细胞周期阻断，用于化疗药物同步化研究

○空间转录组整合：组织切片EdU信号与测序数据叠加，关联“增殖热点”与基因表达域（如肿瘤异质性区域）

○AI驱动图像分析：基于EdU标记的清晰核轮廓训练深度学习模型，自动识别罕见增殖事件（如转移灶微克隆）

德国癌症研究中心团队通过EdU脉冲追踪发现：常规BrdU遗漏的静息态肿瘤干细胞，在药物压力下显露出复苏迹象——这一发现为肿瘤复发机制提供了全新解释

要资质有资质

要经验有经验

要案例有案例

好，化学EdU检测法就介绍到这里啦~

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