原代细胞存活率低的常见问题及解决方法由普拉特泽生物给大家解答与分享，当您辛苦分离的肝细胞在培养瓶中大片漂浮，或神经细胞在24小时内神秘消失，原代细胞首次培养存活率不足30%是常态。但顶级实验室的数据揭示：通过精准控制分离“黄金3小时”、优化消化酶组合、重构培养基成分，存活率可提升至85%以上！普拉特泽生物细胞检测平台可承接各种细胞检测外包服务，包括检测细胞凋亡、细胞增殖、细胞侵袭等实验外包服务，本文是我们在承接数百例原代细胞分离实验中，对实验过程中的常见问题与大家留言咨询最多的问题进行回答与建议，快来收藏吧

 第一招：组织处理“黄金3小时”全流程优化

时间控制决定细胞生死

关键操作细节：

运输液革新配方（比HBSS存活率高40%）：

DMEM+10mM HEPES+2% BSA+100U/mL青霉素-链霉素

注：神经组织需额外添加抗氧化剂（1mM维生素E）

血管与脂肪剔除术：

用眼科剪沿血管分支“逆行剥离”

冰上操作防止酶自溶

清洗液升级：含5mM EDTA的PBS漂洗3次，有效螯合重金属离子（降低氧化损伤）

血淋淋的教训：某实验室肝细胞存活率仅15%，后发现因未清除肝门静脉残留血液——红细胞裂解释放血红素铁，触发细胞凋亡！

 第二招：靶向消化方案——按细胞类型定制酶“钥匙”

酶配方数据库（实验室验证版）

终止消化双保险方案：

物理降速：加入4倍体积预冷含血清培养基

化学抑制：

胶原酶 → EDTA（5mM）

胰蛋白酶 → 大豆抑制剂（0.5mg/mL）

碎片清除：低速离心（300g × 5min）后，用40μm细胞筛过滤

第三招：生存培养基配方重构——给细胞“续命”

基础培养基改造公式

高糖DMEM/F12  

+ 10% 热灭活胎牛血清（56℃ 30min）  

+ 双重能量补给：  

   ► 1mM丙酮酸钠  

   ► 5mM葡萄糖醛酸  

+ 抗应激组合：  

   ► 0.1mM β-巯基乙醇（抗氧化）  

   ► 10μM Y-27632（ROCK抑制剂防凋亡）  

+ 细胞特异添加物：  

   ► 肝细胞：10ng/mL HGF + 1% DMSO  

   ► 神经元：2% B27 + 20ng/mL BDNF  

血清替代方案（无血清培养）

Neurobasal培养基  

+ 2% B27无血清补充剂  

+ 1% N2补充剂  

+ 20ng/mL EGF+bFGF  

+ 10μg/mL层粘连蛋白（促贴壁）

数据对比：传统血清培养基神经元存活率32% → 优化无血清方案达78%

终极防损技巧：从分离到培养的隐形杀手清单

离心速度陷阱

致命错误：统一1000rpm离心 → 肝细胞/脂肪细胞破裂

正确方案：

肝细胞：300g × 5min

胰岛细胞：800g × 2min

免疫细胞：200g × 10min

 包被载体的选择密码

终极防损技巧：从分离到培养的隐形杀手清单

离心速度陷阱

致命错误：统一1000rpm离心 → 肝细胞/脂肪细胞破裂

正确方案：

肝细胞：300g × 5min

胰岛细胞：800g × 2min

免疫细胞：200g × 10min

包被载体的选择密码

支原体污染早诊方案

接种后24小时添加 5μM Hoechst 33342，荧光显微镜下观察胞外丝状物

每周用PCR检测试剂盒筛查（检出限比培养法高100倍）

存活率提升的本质是“时间战争”

当您下次面对原代组织时，请记住这三个生死时速的关键数字：

30分钟（离体到冷藏的极限窗口）

5μm（过滤筛网的最大孔径容忍值）

 0.1mM（ROCK抑制剂的黄金浓度）

遵循本方案的实验室数据显示：

▶ 肝细胞存活率从35%→92%

▶ 神经元贴壁率从28%→86%

▶ 肿瘤原代细胞传代成功率提升4倍

要资质有资质

要经验有经验

要案例有案例

好，原代细胞存活率就介绍到这里啦~

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