蛋白酶抑制剂是生物化学和分子生物学实验中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白质样品在提取和纯化过程中被内源性蛋白酶降解

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蛋白酶抑制剂是生物化学和分子生物学实验中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白质样品在提取和纯化过程中被内源性蛋白酶降解

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蛋白酶抑制剂是生物化学和分子生物学实验中不可或缺的工具，主要用于防止蛋白质样品在提取和纯化过程中被内源性蛋白酶降解。那么常见的蛋白酶抑制剂有哪些呢？以下玉珠隆生物小编将对其进行整理并分享给各位小伙伴，希望对您有所帮助。

一、蛋白酶抑制剂的种类（按抑制的蛋白酶类型分类）

蛋白酶种类繁多，因此没有一种“万能”的抑制剂可以抑制所有蛋白酶。通常需要根据样本类型和目标蛋白的特性，可选择几种抑制剂混合使用。

以下是针对主要蛋白酶类型的常用抑制剂：

1. 丝氨酸蛋白酶抑制剂

作用对象：胰蛋白酶（Trypsin）、胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）、凝血酶（Thrombin）等。

常见抑制剂：

PMSF（苯甲基磺酰氟）：最经典、最常用的抑制剂。毒性极大，不稳定，在水溶液中会快速失效（半衰期约30分钟），必须在临用前从乙醇或异丙醇储备液中加入。

AEBSF：水溶性更好，毒性低于PMSF，且更稳定，常作为PMSF的替代品。

Aprotinin（抑肽酶）：一种小分子蛋白质，可逆地抑制多种丝氨酸蛋白酶。

2. 半胱氨酸蛋白酶抑制剂

作用对象：组织蛋白酶（Cathepsin B, L）等。

常见抑制剂：

E64：高效、特异、不可逆的抑制剂。水溶性好，非常稳定。

Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）：可逆抑制剂，既能抑制部分半胱氨酸蛋白酶，也能抑制一些丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶）。

3. 天冬氨酸蛋白酶抑制剂

作用对象：胃蛋白酶（Pepsin）、组织蛋白酶D（Cathepsin D）、肾素（Renin）等。

常见抑制剂：

Pepstatin A：一种特异性很强的抑制剂，有效浓度很低（微摩尔级）。难溶于水，通常用甲醇或乙醇配制储备液。

4. 金属蛋白酶抑制剂

作用对象：胶原酶（Collagenase）、嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）、多种金属内肽酶等。这类酶活性依赖于金属离子（如Zn²⁺）。

常见抑制剂：

EDTA（乙二胺四乙酸）/ EGTA：通过螯合金属离子（如Zn²⁺, Ca²⁺）来抑制酶活，并非直接作用于蛋白酶本身。是最常用的广谱金属蛋白酶抑制剂。

1,10Phenanthroline（邻菲罗啉）：也是一种金属离子螯合剂。

5. 氨基肽酶抑制剂

作用对象：从多肽链N端开始水解的蛋白酶。

常见抑制剂：

Bestatin：抑制氨基肽酶B和亮氨酸氨基肽酶。

EDTA：对某些金属离子依赖的氨基肽酶也有效。

6. 蛋白酶体抑制剂

作用对象：26S蛋白酶体复合物。

常见抑制剂：

MG132：可逆抑制剂，广泛用于细胞培养研究，以抑制蛋白质的泛素化蛋白酶体降解途径。

Lactacystin：不可逆的特异性抑制剂。

二、使用方法

1. 基本原则：使用多种抑制剂混合物

由于样本（如细胞、组织）中通常含有多种类型的蛋白酶，强烈建议使用复合型的蛋白酶抑制剂混合物，而不是单一抑制剂。这能确保对各类蛋白酶都有广泛的抑制效果。

2. 两种主要获取方式：

商品化的预混抑制剂：

形式：通常是片剂（溶解于一定体积的裂解液中）或即用型溶液。

优点：非常方便，比例经过优化，广谱高效，避免了自行配制和称量有毒试剂的麻烦。市面上有针对通用、哺乳动物细胞、细菌细胞、组蛋白提取等不同需求的专用混合剂。

推荐：对于常规实验，这是最省时省力且可靠的选择。

自行配制：

根据需要抑制的蛋白酶类型，从上述种类中选择几种，用合适的溶剂（如水、乙醇、DMSO等）配制成高浓度的储备液，然后按比例添加到裂解液或缓冲液中。

优点：成本较低，可根据特定需求灵活调整配方。

缺点：需自行称量有毒试剂，优化比例较麻烦。

3. 一个常用的基础自行配制方案（仅供参考）：

对于常规的哺乳动物细胞/组织蛋白提取，比较常用的抑制剂组合是：

PMSF：1 mM （针对丝氨酸蛋白酶）

Aprotinin：0.31 μM或12 μg/mL

Leupeptin：0.55 μg/mL（针对半胱氨酸和部分丝氨酸蛋白酶）

Pepstatin A：1 μM（针对天冬氨酸蛋白酶）

EDTA：0.51 mM（针对金属蛋白酶）

注意：所有储备液均需分装并于20°C保存。PMSF必须在裂解液临用前加入。

4. 关键步骤和注意事项：

①.预冷：所有操作都应在4°C冰上进行，以降低蛋白酶活性。

②. 提前加入：蛋白酶抑制剂应在裂解开始前就添加到裂解缓冲液中，确保样品一接触裂解液就受到保护。

③. 浓度：遵循产品说明书或文献建议的浓度，过高浓度可能影响后续实验（如蛋白质功能研究、免疫沉淀等）。

④. 稳定性：注意不同抑制剂的稳定性。例如，含有PMSF的溶液应在3060分钟内使用。

⑤. 后续步骤：在纯化后期（如透析、柱洗脱）可能需要补充蛋白酶抑制剂，或在后续步骤中将其去除（如通过透析或脱盐柱），以免干扰蛋白功能。

⑥. 特殊蛋白：对于磷酸化蛋白研究，需要添加磷酸酶抑制剂（如NaF、β甘油磷酸酯、原钒酸钠等），因为蛋白酶抑制剂对磷酸酶无效。

⑦. 安全性：许多抑制剂（如PMSF）有剧毒，操作时应佩戴手套、护目镜，并在通风橱中进行。

小编建议：

对于新手或常规实验，直接购买商品化的蛋白酶抑制剂，按说明书添加到裂解缓冲液中。这是最安全、高效的选择。对于特定需求或大规模实验，可以考虑自行配制，但务必注意安全，并参考文献优化配方。需要牢记的是：低温操作与提前添加抑制剂是保护蛋白质样品不被降解的两个最关键因素。

文源自纯化大师
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