2. 转染适配性：常规细胞可选脂质体转染，难转染的原代细胞、免疫细胞建议采用电转或慢病毒递送系统；

3. 基因表达验证：通过 qPCR 提前确认目标基因在所选细胞系中表达，否则无法通过后续功能实验验证敲除效果。
   

   
   

                                        新手贴士：若时间紧张，可直接选用 8000 + 现货 KO 细胞库资源，涵盖常见研究基因，即拿即用无需自行构建。

• 解冻操作：37℃水浴锅中快速晃动冻存管，待冰晶剩余 1/3 时立即取出，避免温度过高导致细胞损伤；

• 离心保护：1000rpm 离心 5 分钟后，用含 10% FBS 的完全培养基重悬，切忌直接吹打细胞团；

• 密度把控：复苏初期细胞密度维持在 5×10⁵ cells/mL，贴壁细胞需静置 6-8 小时再更换培养基。

• 培养基定制：CHO-K1 等工程细胞系可在基础培养基中添加 2mg/L 重组胰岛素，细胞增殖效率提升 17%，蛋白产量提高 51%；

• 气体平衡：CO₂浓度严格控制在 5%，湿度保持 95% 以上，避免培养基 pH 波动超过 0.2；

• 传代时机：贴壁细胞融合度达 70%-80% 时传代，悬浮细胞密度至 2×10⁶ cells/mL 时稀释，过度密集易导致细胞凋亡。

• 极限稀释法：将细胞稀释至 0.5 个 / 孔，添加 20% 条件培养基（同系细胞上清），克隆形成率提升 30%；

• FACS 分选法：对带荧光标记的细胞进行单细胞分选，适用于难筛选的悬浮细胞，分选后需静置 24 小时再观察；

• 克隆鉴定：至少扩增 50-100 个单克隆，通过 PCR + 测序确认双等位基因敲除，避免杂合克隆干扰实验。

• 问题根源：sgRNA 设计不合理或转染方式错配；

• 解决策略：

• 用 CRISPick、CHOPCHOP 工具设计 GC 含量 40%-60% 的 sgRNA，优先选择早期外显子靶点；

• 难转染细胞采用 Cas9 RNP（蛋白 + sgRNA 复合物）瞬时递送，降低脱靶同时提升效率。

• 问题根源：双等位基因编辑概率低（通常 < 10%），或目标基因为必需基因；

• 解决策略：

• 同时设计 3 个不同 sgRNA 靶点，编辑效率可提升至 40% 以上；

• 必需基因改用条件性 KO 或 CRISPRi（基因沉默）方案，避免细胞死亡。

• 问题根源：培养基营养不足或存在支原体污染；

• 解决策略：

• fed-batch 培养模式中，每 48 小时添加含 8mg/L 重组胰岛素的补料培养基，蛋白产量提高 49%；

• 每周用 PCR 检测支原体，污染细胞用 0.1% 庆大霉素处理 24 小时。

• 问题根源：Cas9 持续表达或 sgRNA 同源性过高；

• 解决策略：

• 选用高保真 Cas9 蛋白，减少非特异性切割；

• 验证阶段结合 Sanger 测序（基因组层面）+Western Blot（蛋白层面）双重确认。

• 问题根源：冻存液配方不当或降温速度失控；

• 解决策略：

• 采用 10% DMSO+90% FBS 冻存液，贴壁细胞可额外添加 5% 海藻糖；

• 程序降温盒中 - 80℃静置 12 小时后转移至液氮，避免直接冷冻。
  

• 
  

1. 基因组层面：PCR 扩增目标基因片段，Sanger 测序确认移码突变或片段缺失；

2. 蛋白层面：Western Blot 检测目标蛋白表达，无条带或条带显著减弱即为有效敲除；

3. 功能层面：通过流式细胞术、免疫荧光或细胞增殖实验验证表型变化，例如肿瘤相关基因 KO 后需检测细胞凋亡率。

1. 设计工具：源井生物 EZ-editor™系统（1 分钟生成 3 套敲除方案）、CRISPOR（脱靶预测）；

2. 培养试剂：无血清化学成分限定培养基（适合 CHO-K1 细胞）、重组胰岛素补料（提升产能）；

3. 验证试剂盒：T7E1 核酸酶检测试剂盒（快速评估编辑效率）、WB 内参抗体（确保实验可靠性）。