KO细胞株的构建介绍由普拉特泽生物特色服务平台总结分享，特色服务平台为广大科研实验人员提供ko技术服务、蛋白原核表达服务、TSA技术服务先一起来学习学习如何构建出KO细胞——
基于CRISPR/Cas9的原理，在细胞中转染cas9/gRNA表达载体后，cas9-gRNA表达并切割，此时细胞分为四种：转染阴性、转染阳性（未被编辑、被编辑但未成功敲除、成功敲除）；通过抗性可筛选出转染阳性细胞，但不能筛选出成功敲除的细胞，所以需要通过筛选单克隆得到成功敲除的细胞～

1.在转病毒的前一天将目的细胞铺到 12孔板，以第二天密度达 30-50%为宜(铺板的时候种梯度密度，第二天选取密度合适的孔)3.转病毒:弃旧培养基，更换新的完全培养基，将病毒液解冻后加入孔板，轻轻摇匀使病毒液均匀分布

2.病毒感染 24h 后撤掉病毒液，换新鲜培养基，继续培养1天5.将孔板内细胞转入 T25 培养瓶,并加入对应抗性的药物(嘌呤、G418、潮霉素等)筛选转染阳性的细胞

3.根据细胞生长情况筛选 3-7天，铺板提蛋白验证混合克隆的敲低效率，同时收细胞 DNA 进行sanger 测序，根据测序结果和混合克隆敲低效率，选择两个片段(一般会有三个SgRNA)筛选单克隆细胞7.单克隆筛选:a.流式分选:提前在96孔板加好100mL/孔培养基，将细胞消化后上机分选即可，一个液滴只有一个细胞

b.极限稀释法:将细胞消化后计数，取200个细胞制备细胞悬液(100mL培养基中含有一个细胞)，取100L/孔接种于96孔板8.挑选单克隆细胞:96 孔板培养1-2周后显微镜下挑选出单个细胞克隆的孔，做好标记并补加100mL培养基继续培养1周左右(培养时间视细胞生长情况而定)

4.筛选与鉴定:将96孔板内单克隆细胞消化至12孔板，长满后将细胞消化，取1/3至6孔板保种，2/3接种至另一个6孔板用于提蛋白鉴定目的基因是否成功敲除

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