大家好！今天普拉特泽生物继续带大家一起学习新实验——原代细胞分离培养与鉴定，原代细胞（直接从机体组织分离的细胞）是生物医学研究的“黄金标准”，因其更接近体内真实状态，在疾病机制、药物筛选、细胞治疗等领域不可替代！但分离难、污染多、活性低让无数新手头疼。普拉特泽生物细胞实验平台长期为大家提供原代细胞分离实验代做外包服务，别慌！这篇零基础保姆级Protocol，手把手带你通关全流程，从取材到鉴定一次成功！

一、核心原理速懂

什么是原代细胞？

从组织（如肝脏、肿瘤、胚胎）直接分离、未经传代的细胞，保留体内关键特性（一般培养≤10代）。

为什么用原代细胞？

→ 避免细胞系长期培养的基因漂移

→ 构建疾病模型更精准（如原代肿瘤细胞筛药）

→ 符合临床转化研究需求

二、手把手Protocol：分离→培养→鉴定

Step 1：取材与预处理 | 成败关键第一步！

工具准备：预冷PBS、无菌眼科剪/镊、冰盒、含双抗的培养液

操作重点：

新鲜至上：组织离体后4-6h内处理（超时请4℃保存或冻存）

严格清杂：剔除脂肪、血管、坏死组织（防污染！）

快速漂洗：用含400U/mL抗生素的PBS洗3次，去除血污

新手技巧：胚胎组织（如鼠胚）比成体更易培养，首推练习！

Step 2：细胞分离 | 机械法vs酶消化法

避坑提示：

酶浓度过高→细胞损伤！胶原酶推荐0.1-0.3mg/mL，胰酶0.05-0.25%8

加入DNA酶I（100-300U）防DNA粘连，提升细胞分散度5

Step 3：细胞纯化 | 去除杂质提纯度

红细胞去除：加20% BSA悬浮→1000×g离心20min，吸中间白膜层细胞5

免疫磁珠分选（进阶）：用CD抗体标记靶细胞（如原代免疫细胞），纯度＞90%1

Step 4：原代培养 | 防污染保活性

培养基配方：

基础：DMEM/F12 + 10-20%胎牛血清（FBS）

强化：添加1%原代细胞特制添加物（如胰岛素、EGF）310

培养条件：

 接种密度：5×10⁴~1×10⁵ cells/cm²（密度过低难存活）

环境：37℃ + 5% CO₂，首日勿移动培养瓶！49

紧急抢救：若24h未见贴壁，补加5%大鼠血清临时促贴附5

Step 5：细胞鉴定 | 三招确认身份

形态学观察（初筛）：

上皮细胞→铺路石样排列

成纤维细胞→梭形散射生长1

免疫荧光/组化（金标准）：

靶标蛋白检测（如角蛋白CK18标记上皮细胞）1

STR分型（防交叉污染）：

对细胞做DNA指纹图谱，匹配源组织1

Step 6：传代与冻存 | 可持续利用

传代时机：细胞融合度达80-90%（过密会老化！）4

消化关键：

用0.25%胰酶+0.02% EDTA，37℃消化≤3min

加血清中和，离心重悬按1：2~1：3传代910

冻存方案：

细胞悬液 + 冻存液（10% DMSO + 70%培养基 + 20% FBS）  

→ 梯度降温：室温→4℃（20min）→-80℃（过夜）→液氮:cite[4]:cite[10]  

三、新手高频翻车点急救指南