大家好！今天普拉特泽生物继续跟大家一起学习新的实验——细胞DNA提取步骤。

首先我们看看原理——

    实验原理DNA是一种带有负电荷的高分子聚合物，在水中溶解度较高，但在异丙醇等有机溶剂中溶解度较低。当细胞裂解后，DNA在水相中溶解，而蛋白质和多糖等其他细胞成分则在有机相中溶解。异丙醇加入后，改变了溶液中水分子的排列，减少了水分子与DNA之间的氢键作用，使得DNA分子间的相互作用增强，从而促使DNA沉淀。另外，异丙醇还能引起蛋白质变性，通过破坏蛋白质的二级和三级结构，减少蛋白质与DNA之间的相互作用，使得DNA更容易从蛋白质中分离出来。异丙醇提取过程中，许多细胞内的多糖、脂质和蛋白质等杂质会留在水相中，而不与DNA一起沉淀，从而实现了DNA与这些杂质的分离。通过离心可以收集到含有DNA的沉淀，然后使用70%的乙醇进行洗涤，以去除残留的盐分和有机溶剂。最后，DNA沉淀被重悬于适当的缓冲液中，得到相对纯净的DNA样品。

2.试剂配制及原理

Tris（三羟甲基氨基甲烷）：是一种常用的缓冲剂，能够维持溶液的pH值相对稳定。在细胞裂解过程中，Tris能够防止pH变化对酶活性的影响，保护细胞内的酶和蛋白质在裂解过程中不被破坏。EDTA（乙二胺四乙酸）：是一种强力的金属离子螯合剂，能够与多种金属离子（如Ca2+、Mg2+、Fe2+等）形成稳定的复合物。在细胞裂解液中，EDTA可以去除这些金属离子，防止它们对酶活性的抑制或激活，以及避免金属离子催化的氧化反应损伤蛋白质和核酸。

另外，EDTA通过螯合金属离子，可以抑制一些需要金属离子作为辅因子的核酸酶的活性，从而保护DNA和RNA不被降解。SDS（十二烷基硫酸钠）：是一种阴离子表面活性剂，能够破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白质变性。同时它能够与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物，增加蛋白质在溶液中的溶解度，防止蛋白质沉淀。

3实验步骤 1、裂解细胞：当细胞汇合度≥60%时，即可提取细胞的DNA。先吸弃细胞培养基，加PBS清洗一遍，然后加入胰酶消化，消化完成后加1mL培养基把细胞吹打下来，将细胞悬液移至干净的15mL离心管中，1000rpm，3min离心，弃上清。加入5mL（1个3.5cm皿）细胞裂解液和50μL蛋白酶K(20mg/mL)吹散细胞。2、55℃过夜3、加入等体积的异丙醇(5mL)，上下颠倒混匀，出现DNA沉淀，用枪头将DNA沉淀挑至新的Ep管中。（若DNA沉淀较少，则需要离心并弃上清）。4、加入1mL新鲜制备的70%的乙醇，上下颠倒10次以洗涤沉淀，离心，弃上清，把物质转移到新的Ep管中。5、空离Ep管，晾干。6、加入100μL ddH2O，65℃，1h，溶解DNA。7、检测DNA浓度，然后放-20℃保存。

今天关于细胞DNA提取步骤就分享到这儿啦~如果您在实验过程中遇到技术问题，或者需要实验外包和代做，可与我们技术老师联系18570028002（微信同号）