【科研专题】自噬研究全解析（二）想研究自噬流？这几种检测方法你得知道！

大家好！今天普拉特泽生物继续跟大家一起学习【科研专题】自噬研究全解析（二）。想研究自噬流？这几种检测方法你得知道！

自噬，这一细胞内高度保守的降解过程，就像细胞专属的 “清洁队”，能清除受损的蛋白质、细胞器，维持细胞内环境稳态，在发育、免疫和疾病发生发展等多个生理、病理过程中扮演关键角色。自噬流，描述的正是自噬发生过程中，自噬体形成、与溶酶体融合，以及底物降解的这一动态流程。检测自噬流，对理解自噬机制、疾病发生发展及寻找干预靶点至关重要。

检测自噬流的方法有多种，以下是一些常见的方法：

电镜观察自噬体的形成——自噬检测金标准

自噬体属于亚细胞结构，需要使用透射电子显微镜观察自噬体的形态。

电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构特征

Western blot 检测自噬相关蛋白

LC3贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。利用WB检测LC3- 11/I比值的变化以评估自噬的强弱。LC3-I/II 的形成和降解是一个动态过程，瞬时LC3-I I表达不能反映自噬程度，需增加自噬的抑制剂、自噬的激动剂，正反证明自噬的发生。

p62作为自噬的重要受体，主要依赖于自噬途径进行降解。因此，P62的蛋白水平也常常用来指示自噬的降解情况。

LC3 双荧光标记法：观测自噬流的神器

mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系让自噬研究更上一层楼！自噬流的顺畅对细胞生理功能至关重要哦！

这个方法是用同时带有 RFP 和 GFP 的病毒感染细胞。GFP 在酸性环境下会淬灭，而 mRFP 不受影响。当自噬发生时，会看到明亮的黄色荧光，这就是被红色荧光和绿色荧光同时标记的自噬体啦！当自噬体和溶酶体融合，pH 值降低，GFP 荧光淬灭，就只能看到红色荧光了呢！所以，GFP 的减弱表示自噬溶酶体形成顺利，GFP 越少，自噬小体到自噬溶酶体的流通就越顺畅。反之，融合被抑制，自噬溶酶体进程就受阻了哦！而 mRFP 一直稳定表达，通过 GFP 与 mRFP 的荧光比例就能评价自噬。

在研究自噬过程中，构建自噬双标稳株（如mRFP-GFP-LC3系统）需要配套的质粒、病毒和抗体工具。以下是普拉特泽生物针对自噬双标研究的全面推荐，涵盖质粒、病毒和抗体，帮助您高效开展实验。
常用的病毒工具推荐

（1）慢病毒（Lentivirus）

特点：高效感染多种细胞类型，可稳定整合到基因组中，适合构建稳定细胞系。

推荐病毒：

Lv-LC3B-oe(mCherry,GFP)慢病毒

Lv-LC3-oe(RFP，GFP)慢病毒

以上两种均可用于构建自噬双标稳株、监测自噬体形成。

（2）腺病毒（Adenovirus）

特点：高感染效率，适合短期表达实验。

推荐病毒：

Adv-LC3B-oe(mCherry,GFP)腺病毒

Adv-LC3B-oe(RFP,GFP)腺病毒